鼠抗人CD52单克隆抗体制备

摘要

人类CD52抗原属于一个只有十二个氨基酸残基（GQNDTSQTSSPS）的GPI锚定糖蛋白，N末端在3位天冬酰氨上连接有一个具有负电荷唾液酸残基的复杂的糖基，C末端通过与GPI锚连接而使整个分子固定在细胞膜上。CD52抗原广泛分布于淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等造血细胞上以及雄性生殖上皮细胞表面。CD52在细胞上表达密度高，就淋巴细胞而言每个淋巴细胞上约有450000个分子，约占到细胞表面成分的5％，因此成为了抗体攻击的理想的靶抗原。在1980年剑桥大学就发现了CD52抗体能在体外通过加入人的补体后杀伤带有CD52抗原的靶细胞。因此寻找到有杀伤抑制作用的CD52抗体具有重要的应用价值。至今最成功的抗CD52抗体药物是Alemtuzumab（campath-1H），是一个经过人源化改造的抗CD52单克隆抗体，被成功用于一些慢性淋巴细胞白血病和自身免疫疾病的治疗和研究。
　　 本课题主要是采用杂交瘤技术制备功能性的抗人CD52单克隆抗体，同时建立稳定CD52真核转染细胞系，以便于快速准确筛选抗人CD52单克隆抗体。实验方法如下：
　　 首先，应用HUT-78细胞提取细胞总RNA，运用RT-PCR方法扩增CD52基因，定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+），用脂质体转染法转染CHO细胞，建立稳定转染的CHO细胞系，用RT-PCR、FACS、免疫组织化学技术检测转染细胞系中目的基因和蛋白的表达。
　　 其次，根据NCBI提供的CD52抗原的结构特点及campath-1H作用的抗原表位特点，设计合成了靠近CD52抗原C基末端的八个氨基酸的短肽，用于免疫和筛选抗人CD52单克隆抗体。
　　 最后，采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠，进行细胞融合与培养，用合成肽CD52-BSA进行间接ELISA实验初步筛选，通过FACS和Western blot鉴定抗体，MTS实验筛选鉴定有细胞抑制作用的抗体。
　　 结果显示建立了稳定转染的CHO细胞系，初步筛选鉴定出两株抗人CD52单克隆抗体，为进一步研究单克隆抗体的功能和鼠抗体人源化改造奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

前 言

一、材料与试剂

1.主要仪器

2.菌株和载体

3.细胞系

4.主要试剂

5.引物和合成肽

6.实验动物

7.主要溶液配制

二、实验方法

1.稳定转染细胞系的建立

1.1 引物设计与CD52 cDNA扩增

1.2 真核表达载体的构建

1.3 建立稳定转染细胞系

1.4 稳定转染细胞系鉴定

2.单克隆抗体的制备与鉴定

2.1 动物免疫

2.2 细胞融合

2.3 杂交瘤细胞培养、筛选、冻存

2.4 抗体鉴定

三、实验结果

1.人CD52 cDNA的扩增与测序

2.pcDNA3.1（+）/CD52真核表达载体构建

3.pcDNA3.1（+）/CD52重组载体测序结果

4.稳定转染细胞系的鉴定

5.鼠血清多克隆抗体的检测

6.单克隆杂交瘤细胞株的建立

7.单克隆抗体特异性的鉴定

7.1 ELISA检测抗体

7.2 流式细胞术检测抗体

7.3 Western blot鉴定抗体

7.4 细胞间接免疫荧光显微镜检测

7.5 外周血流式细胞分析抗体

7.6 单克隆抗体亚类与型鉴定

四、讨论

五、结论

参考文献

综述

参考文献

常见英文缩写

致谢

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