肺成纤维细胞表面Thy-1的表达和表观遗传药物影响下的增殖和分化

摘要

一、IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达及在TGF-β刺激下的表达差异 目的：建立肺成纤维细胞的培养方法，为肺纤维化的发病机制和治疗措施体外研究提供细胞技术平台；探索IPF和非IPF患者肺成纤维细胞株的亚群差异。 方法：采用肺组织块接种培养法，培养的细胞通过相差显微镜和透射电镜观察形态、免疫细胞化学染色检测细胞表型标记蛋白等进行鉴定，流式细胞术检测各种情况下表面Thy—1的阳性率，并用流式分选系统(FACS)分选出Thy—1(—)细胞。 结果：培养的IPF患者成纤维细胞株细胞呈梭形，单个核，多突起，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长，表达波形蛋白(vimentin)和平滑肌肌动蛋白(α—SMA)，不表达角蛋白(cytokeratin)和结蛋白(desmin)。电镜观察到胞质中有丝状a—SMA纤维。IPF成纤维细胞株的表面抗原Thy—1阳性率明显低于正常成纤维细胞株，并分成明显的Thy—1阳性和阴性两个亚群。TGF-β刺激后IPF成纤维细胞株的Thy—1的阳性率降低比正常细胞株明显。 结论：原代培养的IPF患者成纤维细胞株细胞含有肌成纤维细胞(MyoF)并且可以传代，可分选出Thy(—)细胞，为后续实验提供了基础。成纤维细胞表面抗原Thy—1的阳性率在纤维化肺组织和正常肺组织是有显著差异的，经TGF-β刺激后其差异更加明显。 二、表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠对肺成纤维细胞增殖及分化的影响 目的：探索表观遗传药物对IPF患者肺成纤维细胞株的干预影响，以期为肺纤维化的治疗提供一个新的选择。 方法：用DNA甲基化酶抑制剂5—氮杂胞苷和组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠处理IPF患者肺成纤维细胞株，地塞米松为对照。用噻唑兰MTT细胞增殖实验定量检测细胞株的增殖和药物的细胞毒性情况。分别应用流式细胞技术、免疫细胞化学法观察各药刺激前后该细胞株表面Thy—1表达的变化和细胞平滑肌肌动蛋白(α—SMA)的表达差异。 结果：IPF患者肺成纤维细胞株在DNA甲基化酶抑制剂5—氮杂胞苷处理24小时后可明显抑制增殖，5μmol/l作用48小时后表面抗原Thy—1的阳性率上升为93.7％±1.95％，5μmol/l处理5天后α—SMA的阳性率下降为49.2％±6.4％(p<0.05)。在丙戊酸钠处理24小时后显著抑制增殖，10 mg/ml作用48小时后表面抗原Thy—1的阳性率上升为95.5％±2.21％，10 mg/ml处理5天后α—SMA的阳性率下降为36.6％±6.9％(p<0.05)。地塞米松虽然可明显抑制IPF患者肺成纤维细胞株的增殖，5μmol/l剂量作用24小时后表面抗原Thy—1的阳性率上升为87.7％±1.46％，但在5μmol/l剂量作用5天后α—SMA的阳性率为86.3％±4.9％(p>0.05)。 结论：表观遗传药物DNA甲基化酶抑制剂5—氮杂胞苷和组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠能够抑制IPF患者肺成纤维细胞株的增殖，在相应的亚细胞毒性剂量上可导致细胞表面抗原Thy—1的表观上调，使肌成纤维细胞的特征标记物平滑肌肌动蛋白α—SMA表达降低。在肺纤维化的治疗中具有应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

实验流程图

第一部分IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达及在TGF-β刺激下的表达差异

前言

实验对象和材料

一、肺组织来源：

二、细胞因子：

三、主要耗材：

四、主要试剂：

五、主要仪器：

实验方法

一、人肺成纤维细胞原代培养（组织块法）：

二、成纤维细胞的鉴定：

三、流式细胞术(FCM)：

四、流式分选术(FACS)：

结果

一、成纤维细胞的鉴定：

二、IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达和在TGF-β刺激下表面Thy-1的表达差异：

三、IPF患者肺成纤维细胞分选结果（图五）：

讨论

小结

参考文献

第二部分表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠对肺成纤维细胞增殖及分化的影响

前言

实验材料

一、细胞来源及细胞培养：

二、表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠以及地塞米松：

三、主要耗材：

四、主要试剂及试剂盒：

五、主要仪器

实验方法

一、细胞增殖试验(噻唑兰MTT试验)：

二、流式细胞术(FCM)：

三、免疫细胞化学法：

四、统计学处理

结果

一、5-氮杂胞苷、丙戊酸钠和地塞米松刺激下IPF成纤维细胞的生长情况和各药物对细胞增殖的抑制情况。

二、表观遗传药物和激素刺激后IPF患者肺成纤维细胞株表面Thy-1的表达差异：

三、表观遗传药物和激素刺激前后IPF成纤维细胞α-SMA的表达差异：

讨论

小结

参考文献

综述 Thy-1——影响肺纤维化发展的成纤维细胞亚群的特征标记分子

附录主要溶液的配制

致谢