猪骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞分化过程中Notch4下调

摘要

目的：检测猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)体外培养自发分化和诱导分化过程中Notch4mRNA、Notch4蛋白的变化趋势，探讨Notch4受体对MSCs体外向心肌细胞分化的影响。
　　 方法：密度梯度离心法分离中华小型猪骨髓单个核细胞，贴壁培养法筛选出MSCs体外培养，原代(PO)培养后按1:2比例每3天传代一次。选取第1，2，3和4代(P1，P2，P3和P4)MSCs，连续镜下观察MSCs的形态变化，同时检测自发分化和5.氮胞苷诱导分化状态下它们Notch4mRNA水平和Notch4蛋白表达量的差异。RealTimeRT-PCR定量检测细胞Notch4mRNA表达量，以及心肌结构基因和特异性基因的表达量，包括Cx43和cTnl；Western-blot法检测不同细胞Notch4蛋白的表达水平；免疫细胞化学染色法检测MSCs的表面标志(CD34、CD45、CD90和CD29)及心肌细胞特异性的蛋白表达，包括a-横纹肌肌动蛋白(a-sarcomericactin，a-actin)、心肌肌钙蛋白-T(cardiactroponin-T，cTn-T)和连接蛋白43(connexin43，Cx43)；以透射电镜观察分化细胞超微结构。
　　 结果：5天可见贴壁圆形的MSCs逐渐出现多角状突触，呈长梭形，经过7-10天培养，原代(passage0，P0)MSCs形成均一的细胞克隆，融合70-80％；1:2传代以后第二天细胞即可贴壁生长，细胞为多角长梭形，数量增殖到较多时呈漩涡状生长。免疫细胞化学表型鉴定CD45(-)，CD29(+)，CD90(+)。猪骨髓来源的MSCs在体外正常培养状态下，随着培养时间的延长(PO-P4)，细胞之间的连接增多(Cx43表达量上升)，心肌特异性标志物增多(cTnI表达量上升)，与此同时Notch4较原代细胞显著下调；5-氮胞苷(10μM)诱导2周后，Notch4的基因表达与对照组相比无明显变化，Notch4阳性细胞与对照组相比显著减少，各代MSCs可以生成更多的细胞连接，但是心肌特异性标志物无显著变化。
　　 结论：猪骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞分化过程中Notch4下调。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

前言

材料和方法

1.主要试验仪器和材料

1.1 动物

1.2 试验仪器

1.3 试验器材

1.4.主要试验试剂及配制

2.试验方法

2.1.骨髓单个核细胞分离和MSCs的获取

2.2.MSCs培养和传代

2.3.体外诱导分化为心肌细胞

2.4.免疫细胞化学方法检测MSCs表型和分化

2.5 透射电镜观察细胞超微结构

2.6.Real time RT-PCR检测基因表达

2.7 Western-blot试验检测Notch4蛋白的表达

2.8.统计学分析

结 果

1.猪骨髓MSCs体外培养特性：形态学观察及表型鉴定

2.不同代数MSCs的Notch4表型

3.不同代数MSCs的分化情况

讨论

结论

参考文献:

致 谢