MITOFILIN通过与TFAM的结合影响线粒体DNA的转录

摘要

线粒体氧化磷酸化系统是机体的能量工厂，它为机体的生命活动提供绝大部分的能量，该系统功能失常可导致多种疾病的发生，包括遗传性线粒体疾病、衰老及相关病变。氧化磷酸化系统是由5个复合物组成，这些复合物的组成亚基由核DNA和线粒体DNA共同编码，其中，线粒体DNA编码的13个亚基是线粒体复合物所必需的，而mtDNA的转录异常可引起呼吸链复合物的异常，进而影响线粒体的氧化磷酸化。因此，线粒体DNA的转录调节对于氧化磷酸化适应机体的能量需求非常重要。
　　 Mitofilin是一种线粒体内膜蛋白，为了深入研究该蛋白在氧化磷酸化中的作用，孙立红博士和杨瑞峰博士建立了IMMT敲除鼠，并发现IMMT-／-胚胎死于胚胎期7.5天-10.5天之间；而且IMMT-/-胚胎和IMMT+／-鼠中有mtDNA编码的亚基参与的复合物酶的活性明显下降，而全部由核基因编码的亚基组装的复合物Ⅱ的活性没有明显变化这一证据，我们推测Mitofilin可能是通过影响线粒体DNA的转录来调节氧化磷酸化系统。
　　 为了进一步研究Mitofilin在线粒体DNA转录中的作用，我们首先通过蛋白质免疫共沉淀和MBP-pulldown的实验方法，我们发现，Mitofilin可与线粒体转录因子TFAM、TFB1M和TFB2M相互作用。通过RNA干扰实验、线粒体DNA免疫共沉淀和RealtimePCR实验，我们发现Mitofilin的下调导致TFAM在线粒体DNA启动子区的结合减弱；基于上述这些实验证据，我们推测Mitofilin可与结合在启动子区的TFAM结合启动线粒体DNA的转录。这种调节可能是线粒体氧化磷酸化系统适应机体能量需求的有效调节方式。

目录

前言

1 线粒体是一具双层膜的半自主细胞器

2 线粒体的基本功能

2.1 线粒体氧化磷酸化：

2.2 活性氧的产生

3 线粒体基因组的唯一调控区介导线粒体DNA的转录复制

3.1　类核体是线粒体的"染色体"

3.2 线粒体DNA的复制

3.3 线粒体DNA的转录调节及其相关转录因子

4 线粒体内膜蛋白-Mitofilin

5 本研究的主要研究内容

材料与方法

1 材料

1.1 菌株与质粒

1.2 细胞系及实验用小鼠

1.3 限制性内切酶和主要的工具酶

1.4 抗体

1.5 其他主要试剂及材料

1.6 主要仪器设备

2.实验方法

2.1 基本技术路线

2.2 细菌操作与质粒的转化

2.3 细胞培养

2.4 非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染

2.5 逆转录病毒的包装和靶细胞的感染

2.6 半定量RT-PCR

2.7 Western blot和蛋白质相互作用实验

2.8 线粒体DNA免疫沉淀(mIP)分析

2.9 EMSA

2.10 统计学分析

实验结果

1、Mitofilin与线粒体转录因子相互作用

1.1 Mitofilin与TFAM相互作用

1.2 Mitofilin与线粒体转录因子TFB1M和TFB2M相互作用

1.3 MBP-pull down证明Mitofilin可直接与TFAM和TFB1M结合

1.4 MBP-pull down进一步证明Mitofilin与TFAM的C-末端直接相互作用

2、mIp和EMSA证明TFAM的C末端缺失区可以结合于mtDNA的D-loop区

2.1 mIP证明TFAM可以结合于mtDNA的D-loop区

2.2 凝胶迁移率阻滞实验显示TFAM的C末端缺失区可以与mtDNA结合

3 Mitofilin的缺失减少TFAM在线粒体DNA D-loop区的结合

3.1 干扰mitofilin的逆转录病毒的构建和表达

3.2 mIP检测在mitofilin干扰的细胞中TFAM的与线粒体DNA的结合明显减弱

4、Mitofilin+/-小鼠氧化磷酸化复合物活性较野生型降低

4.1 Mitofilin+/-小鼠中复合物Ⅰ、Ⅳ的表达降低

4.2 体内外酶学实验发现复合物I和复合物Ⅰ／Ⅲ的活性也有一定程度的下降

讨论

1 Mitofilin可募集转录起始复合物于mtDNA启动子区

2 Mitofilin是机体调节能量需求的重要因子

3 Mitofilin对线粒体DNA转录调节的生理意义

4 本研究的不足与展望

小结

参考文献

综述

英文名词及缩写

致谢

个人简历

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