sPLA-ⅡA对正常人单核诱导的巨噬细胞胆固醇外流的影响

摘要

动脉粥样硬化过程是大血管及中血管的一种慢性炎症，大量研究表明，在心血管病患者血清中分泌型磷脂酶型A2的IIA亚型（sPLA2-IIA）水平会升高，而且升高的程度与疾病的严重程度相关。许多研究证实sPLA2-IIA不仅仅是动脉粥样硬化的危险因子和发生冠状动脉事件的预测因子，而且在动脉粥样硬化的发生和发展中起着一定的作用。目前关于sPLA2-IIA的抑制剂（Varespladib）已经进入Ⅱ期临床研究，但是sPLA2-IIA在促进动脉粥样硬化的发展进程中机制尚未完全清楚。胆固醇的逆转运是在动脉粥样硬化的发生的关键环节，其初始环节为胆固醇外流。本研究旨在探讨sPLA2-IIA对于胆固醇外流环节的影响。
　　 研究目的
　　 1.探讨不同浓度sPLA2-IIA对正常人外周血单核巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SRB1的mRNA及蛋白的表达情况的影响。
　　 2.通过以HDL和ApoA1为接受体，研究不同浓度sPLA2-IIA干预后正常人单核巨噬细胞的胆固醇外流功能。
　　 方法
　　 1.选取正常人外周血经过Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC），贴壁法进行筛选，M-CSF刺激培养使单核细胞巨噬化。CD68免疫组化染色鉴定巨噬细胞。
　　 2.Real-Time PCR方法检测不同浓度sPLA2-IIA对正常人单核巨噬细胞上干预24h后ABCA1、ABCG1、SRBI的mRNA表达的影响。
　　 3.Western Blot方法检测不同浓度sPLA2-IIA对正常人单核巨噬细胞干预24h的ABCA1、ABCG1、SRB1的蛋白表达。
　　 4.H3胆固醇标记巨噬细胞，经过不同浓度sPLA2-IIA干预24h后分别以HDL为接受体，观察经ABCG1通路的胆固醇外流；以apoA1为接受体，观察经ABCA1通路的胆固醇外流。
　　 5.统计分析：采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以X±SD表示，组间比较以one-way ANOVA进行分析。
　　 结果：
　　 1.1）Real-Time PCR检测结果发现随着sPLA2-IIA浓度的增加，ABCA1mRNA表达呈下降趋势；当sPLA2-IIA为0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml刺激巨噬细胞后ABCA1mRNA较空白对照组下降（P<0.01），但3个浓度组间的ABCA1的表达无明显差别；1μg/ml的sPLA2-IIA对ABCA1表达抑制最为明显，相对于其他浓度组亦有明显的抑制作用（P<0.01）；2）sPLA2-IIA浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml时，对ABCG1mRNA呈抑制趋势，但未达到统计学差异；随着浓度增加，该差异逐渐明显，当sPLA2-IIA浓度为1μg/ml可明显抑制ABCG1的表达（p=0.033）；3）sPLA2-IIA为0.5μg/ml及1μg/ml时对SRB1mRNA有着较明显的抑制作用，P值分别为0.011和0.007。
　　 2.Western Blot检测结果发现经过各浓度sPLA2-IIA干预24小时ABCA1、ABCG1、SRB1的蛋白表达在各组之间无显著差异。
　　 3.经过各浓度sPLA2-IIA干预24小时后由HDL和ApoA1介导的胆固醇外流率均有下降趋势，但尚未达到统计学差异（P>0.05）。
　　 结论
　　 1.经过sPLA2-IIA不同浓度干预正常人单核细胞衍生的巨噬细胞24小时，本研究的各干预浓度均对ABCA1的基因表达水平起抑制作用；sPLA2-IIA1μg/ml时可影响ABCG1的基因表达下降；而SRB1基因水平在sPLA2-IIA0.5μg/ml及1μg/ml亦受到抑制的作用。
　　 2.本研究sPLA2-IIA2各浓度在干预正常人巨噬细胞24小时后并不改变ABCA1，ABCG1及SRB1的蛋白表达水平的改变。
　　 3.随着sPLA2-IIA浓度逐渐升高，由ApoA1，HDL介导的正常人巨噬细胞胆固醇外流率有逐渐下降的趋势，但尚未达到统计学差异

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

实验材料

第一部分 正常人外周血单核细胞的分离和巨噬化培养

实验方法

试验结果

第二部分 实时定量PCR检测sPLA2-ⅡA对ABCA1、ABCG1、SRB1mRNA表达的影响

试验方法

试验结果

第三部分 Western blot检测sPLA2-ⅡA对ABCA1、ABCG1、SRB1蛋白表达影响

试验方法

试验结果

第四部分 sPLA2-ⅡA对正常人单核细胞来源的巨噬细胞干预的胆固醇外流试验

试验方法

实验结果

讨论

结论

创新性展望

局限性

参考文献

综述

参考文献

致谢

个人简历