血管内皮祖细胞的基因修饰与体外三维培养的研究

摘要

血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞具有定向迁移分化为成熟血管内皮细胞的能力。参与出生后的血管生成和血管发生，近年来血管内皮祖细胞被广泛用于治疗缺血性心血管疾病和组织工程血管生成的研究中。为了提高血管内皮祖细胞的移植效率，克服传统干细胞移植治疗方法中的不足。将血管内皮祖细胞种植于模拟体内细胞外基质结构的三维载体支架上，进行体外培养和体内移植，是近年来研究的热点。
　　 本研究采用从大鼠骨髓分离单个核细胞，用特定的诱导培养基在体外培养、扩增血管内皮祖细胞。并将构建的表达组织因子途径抑制因子（TFPI）基因的重组逆转录病毒载体包装成逆转录病毒，感染血管内皮祖细胞，获得稳定表达TFPI和GFP基因的血管内皮祖细胞，用复乳有机溶剂挥发法添加蔗糖做为致孔剂，制备了聚乳酸（poly（D，L-lactide），PDLLA）多孔微球，考察了血管内皮祖细胞在RGD修饰的聚乳酸多孔微球载体上的粘附、增殖、分化情况。具体研究内容如下：
　　 为获得一种方便、有效的血管内皮祖细胞分离、培养和扩增方法，本研究选用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞，结合贴壁培养法，在添加特定生长因子的诱导体系培养血管内皮祖细胞。通过观察其生长过程中的形态改变、检测EPCs的功能和表面标志来进行鉴定。倒置显微镜观察，在贴壁培养的第4d出现EPCs集落，细胞呈纺锤形，增长速度快，于培养的第14天集落相互融合，细胞分化成铺路石样细胞。荧光显微镜观察可见大部分EPCs能同时摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1。荧光显微镜观察到培养14d的EPCs CD31、v-WF免疫荧光染色呈阳性。流式细胞仪检测结果显示CD133、Flk-1在诱导培养的3-7d呈升高趋势，至培养的第14d两者的表达量明显降低。在培养的第3、7d，CD31几乎没有表达，至培养的第14d，EPCs的CD31表达量明显升高。以上试验结果证实此方法分离培养后得到的细胞是相对纯度较高的血管内皮祖细胞。
　　 为获得稳定表达TFPI和GFP基因的血管内皮祖细胞，本研究将人全长TFPI的cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中，获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP，酶切图谱证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段，基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符。用构建的重组质粒转染293T细胞，成功包装出含有TFPI和IGFP基因的逆转录病毒，将重组的逆转录病毒感染EPCs，荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示，90％以上的感染细胞中存在GFP表达。RT-PCR分析显示，重组的逆转录病毒感染的。EPCs中TFPI mRNA水平明显增高，ELISA法检测显示，感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达。以上研究结果为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治的研究奠定了良好的实验基础。
　　 用复乳有机溶剂挥发法，同时选用蔗糖做为致孔剂，制备了聚乳酸多孔微球，粒径为100-3001μm左右，微球支架表面孔径为16±3.78μm，球形态好，粒径、孔径均匀分布，通过共价交联的方法用RGD修饰PDLLA多孔微球，修饰后的微球形态无改变，通过红外、XPS等检测技术证实RGD成功修饰多孔微球表面。本阶段的研究为用PDLLA多孔微球作为血管内皮祖细胞的微载体研究奠定了基础。
　　 为考察RGD-PDLLA多孔微球支架的生物相容性，将血管内皮祖细胞种植于RGD-PDLLA多孔微球支架，以未经RGD修饰的PDLLA微球为对照，通过MTT、扫描电镜、荧光染色等生物学性能检测后，对比研究RGD修饰的PDLLA微球对EPCs增，殖和分化的影响。MTT结果显示EPCs种植于多孔微球支架后的第1d、3d、7d，细胞数量逐渐增多，这说明EPCs能够在PDLLA多孔微球支架上生长、增殖。而且RGD-PDLLA多孔微球上细胞数量明显高于未修饰的PDLLA多孔微球支架。扫描电镜和荧光显微镜观察结果与MTT结果相一致。EPCs种植于多孔微球支架后的7d，保持着摄取Di1-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第一节 血管内皮祖细胞的研究进展

1.1.1 概况

1.1.2 血管内皮祖细胞的来源、鉴定、分离和培养

1.1.3 血管内皮祖细胞的动员、趋化与归巢

1.1.4 血管内皮祖细胞的基因修饰

1.1.5 血管内皮祖细胞的移植方式

1.1.6 血管内皮祖细胞在血管性疾病治疗中的应用

1.1.7 血管内皮祖细胞在组织工程中的应用

1.1.8 展望

第二节 细胞三维培养支架的研究进展

1.2.1 概况

1.2.2 细胞三维培养支架材料的分类

1.2.3 细胞三维培养支架的制备方法

1.2.4 细胞三维培养支架表面改性

1.2.5 可注射性细胞微球载体的研究进展

第三节 课题的提出

3.1 本课题的提出

3.2 研究内容

参考文献

第二章 血管内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 实验结果

2.3.1 血管内皮祖细胞的原代培养

2.3.2 血管内皮祖细胞的鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

参考文献

第三章 含TFPI基因的逆转录病毒载体的构建及在EPCs中的表达

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 实验结果

3.3.1 pMSCV-TFPI-IRES-GFP质粒的鉴定结果

3.3.2 TFPI逆转录病毒的包装及在EPCs中表达的结果

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

第四章 RGD多肽修饰的多孔聚乳酸微球的制备与表征

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 实验结果

4.3.1 聚乳酸多孔微球的形态和粒径分布

4.3.2 聚乳酸多孔微球表面结构分析结果

4.4 讨论

4.5 小结

参考文献

第五章 EPCs在聚乳酸多孔微球支架上生长的研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 实验结果

5.3.1 MTT比色法测定细胞增殖

5.3.2 EPCs与聚乳酸多孔微球支架复合培养扫描电镜结果

5.3.3 EPCs与聚乳酸多孔微球支架复合培养荧光显微镜观察结果

5.3.4 EPCs摄取Dil-acLDL、结合FITC-UEA-1功能实验

5.4 讨论

5.5 小结

参考文献

参考文献

全文总结

在学期间发表的学术论文、专利与参加的学术会议

致 谢