砷暴露对小鼠植入前胚胎体外发育的影响及作用机制的研究

摘要

砷暴露对女性生殖系统具有明显的毒性，尤其是生殖细胞，对化学物质非常敏感。植入前胚胎作为人类生命的最初形式，在这段时间胚胎经历了特殊的代谢时期，承受了蛋白合成、能量需求、氨基酸代谢的剧烈变化，是对内外环境因素变化最为敏感的时期。植入前早期胚胎可能对砷更加易感，而它的命运与妇女生育能力、妊娠结局以及后代身体素质的整体状况都有着密切的联系。
　　 长期以来，很多未成年女性在结婚生子以前很长一段时间内一直处于砷暴露的环境当中，但目前对孕前砷暴露对植入前胚胎发育的影响的研究还不充分。因此我们选用3-5周龄未性成熟雌性小鼠，按8mg/kg亚砷酸钠(NaAsO2)剂量隔日腹腔注射一次，共注射8次。然后经过PMSG-hCG超数排卵、体外受精和植入前胚胎体外培养，评价孕前砷暴露对小鼠生殖能力的影响。结果显示：孕前砷暴露导致小鼠排卵能力明显下降，植入前胚胎大部分阻滞在1-2细胞期。与对照组胚胎相比，这些阻滞的胚胎活性氧(ROS)水平升高一倍左右，细胞色素c明显释放，细胞核凋亡率升高36％。这些结果说明孕前砷暴露十分危害随后植入前胚胎的发育，预示着孕前砷暴露可能导致育龄妇女受孕困难。
　　 以往的研究发现，砷通过许多种机制径发挥毒性，例如：染色体异常、DNA修复和甲基化改变、细胞分化异常、基因异常扩增、P53和端粒酶的抑制等。更多的研究认为砷通过ROS产生毒性，但是还不清楚砷导致氧化还原非平衡的具体机制。本研究小鼠孕前砷暴露的结果表明无机砷通过活性氧(ROS)发挥毒性，为了深入揭示砷干预植入前胚胎的机制，我们对体外培养的2-细胞胚胎进行直接砷暴露的研究。
　　 文献报道，p66Shc是一种ROS生成酶。必要时转至线粒体内膜间隙，在此与细胞色素c相互作用，产生H2O2并打开线粒体通透转换孔，将ROS释放至胞浆。我们研究发现高剂量(10uM)砷暴露导致胞内ROS水平升高3倍以上，p66Shc蛋白的表达水平升高一倍左右，而ROS清除剂，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，能够有效地降低砷暴露胚胎p66Shc的蛋白表达水平，说明p66Shc还是ROS的响应蛋白。这些研究结果预示：在砷的刺激下，p66Shc可能以正反馈的形式造成过多的ROS积聚。谷胱甘肽(GSH)是一种重要的抗氧化剂，帮助细胞抵抗氧化损伤。与成体细胞不同，植入前的胚胎不具备从头合成GSH的能力。我们发现胞内GSH含量由于砷干预而急剧减少。综上，我们认为：砷暴露通过谷胱甘肽的降低和氧化还原接头蛋白p66Shc介导的ROS升高的方式扰乱胞内氧化还原平衡。结果导致细胞色素c-caspase细胞凋亡通路的激活，而不是凋亡诱导因子(AIF)通路。
　　 以前的生化分析显示输卵管和子宫内含有很高水平的自由氨基酸，在早期胚胎发育过程中发挥着重要的生理作用。因此，当早期胚胎遭遇应激反应，其氨基酸代谢将会立即受到干扰。同时，氨基酸代谢水平的高低也预示着胚胎的发育能力。我们利用反向-高效液相色谱法(RP-HPLC)分析胚胎培养基中氨基酸的含量变化，间接地反映胚胎氨基酸代谢的改变。我们发现，低剂量(0.1uM)的砷明显地干扰了植入前胚胎胞外氨基酸消耗与生成，尤其是细胞毒性和抗氧化氨基酸，这也可能是胚胎发育延迟的部分原因。
　　 此外，抗氧化剂NAC通过降低胞内ROS和调整氨基酸代谢，改善了砷暴露胚胎的发育状况，表明提高胞内抗氧化剂的水平可以拮抗或治疗砷导致的胚胎发育毒性。
　　 本研究通过对小鼠孕前和植入前胚胎时期砷暴露，探讨了砷对孕早期的影响及其作用机制。结果显示，较低剂量的砷暴露就能导致植入前胚胎发育延迟或阻滞。研究同时发现，p66Shc相关的氧化还原非平衡和胞外氨基酸代谢异常是砷诱发植入前胚胎发育阻滞和延迟的原因。因此，我们应该给予孕前和孕早期环境砷暴露更多的关注，保护女性生殖健康，为子孙后代身体健康谋福祉。