结核分枝杆菌RD1基因编码抗原特异性细胞反应对活动性结核病与潜伏性结核感染诊断价值及相关基础研究

摘要

背景：中国是全球22个结核病高负担国家之一，早期准确诊断活动性结核病对控制结核疫情至关重要。传统的诊断结核病的方法有很多不足，抗酸染色检出率低，结核分枝杆菌培养需时较长，组织病理学检查常为有创性。结核菌素皮试应用广泛，但免疫抑制状态及卡介苗接种均会影响其诊断的准确性。外周血T-SPOT.TB通过检测机体内结核分枝杆菌RD1编码抗原ESAT-6及CFP-10肽段库刺激后释放Y干扰素的特异性T细胞的数量诊断结核感染，病例对照研究显示，外周血T-SPOT.TB与TST相比不受机体免疫状态及卡介苗接种的影响，具有很好的敏感性和特异性。评价外周血T-SPOT.TB诊断价值的大样本、前瞻性队列研究多在结核低、中流行国家进行，尚未见中国大陆的研究报道。特别是在高流行区T-SPOT.TB诊断活动性结核感染的斑点形成细胞频数界值多少最恰当未见报道。结核性浆膜炎/脑膜炎获得病原学确诊较为困难。在结核高流行地区，高潜伏性结核感染率使得外周血T-SPOT.TB诊断活动性结核病的特异性降低。而在浆膜腔积液患者中，其诊断活动性结核病的敏感性也受到影响。抗原特异性效应T细胞有向病变部位聚集的特点，检测结核分枝杆菌RD1基因编码抗原刺激后浆膜腔积液、脑脊液中释放Y干扰素的特异性T细胞，能更加特异、敏感地诊断结核性浆膜炎和结核性脑膜炎，而对于T-SPOT.TB诊断结核性浆膜炎的界值多少最恰当尚未见文献报道。医务工作者与普通人群相比具有高结核分枝杆菌感染风险，但普遍接种BCG会使TST的结果产生“假阳性”，应用T-SPOT.TB对中国综合医院医务工作者潜伏性结核感染尚未见研究报道。结核分枝杆菌侵入机体后引起的获得性免疫反应以细胞免疫为主，CD4+T细胞在其中起重要作用。探讨不同结核感染状态中结核分枝杆菌RD1基因编码抗原特异性CD4+T反应如何有助于加深对结核病的细胞免疫机制的理解；随着治疗后抗原量的下降浆膜腔积液/脑脊液中RD1基因编码抗原特异性细胞的有何变化未见文献报道。
　　 目的：1）评价外周血T-SPOT.TB在结核高流行区对活动性结核病的诊断价值，分析影响外周血T-SPOT.TB诊断活动性结核病的敏感性及特异性的因素；分析释放Y干扰素的结核特异性T细胞数量对于诊断活动性结核病的意义，探讨鉴别活动性结核病与非活动性结核感染（潜伏性结核与陈旧性结核）的斑点形成细胞频数界值。2）建立通过T-SPOT.TB检测患者浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液及关节液）及脑脊液中释放Y干扰素的结核分枝秆菌RD1基因编码抗原特异性T细胞方法；通过与外周血T-SPOT.TB结果比较，评价浆膜腔积液、脑脊液T-SPOT.TB对诊断活动性结核病中的诊断价值；比较外周血与浆膜腔积液、脑脊液T-SPOT.TB的斑点形成细胞频数，探讨诊断活动性浆膜炎的斑点形成细胞频数的界值。3）应用T-SPOT.TB与TST比较诊断综合医院医务工作者中潜伏性结核感染，探讨两者的一致性及潜伏性结核感染的危险因素。4）初步探讨不同结核感染状态中结核分枝杆菌RD1基因编码抗原特异性CD4+T反应；随着治疗（抗原量的下降）浆膜腔积液/脑脊液中RD1基因编码抗原特异性细胞的变化趋势。
　　 方法：1）前瞻性纳入2005年12月至2009年3月北京协和医院收治的住院患者中疑诊活动性结核病或需与活动性结核病相鉴别的患者591例（HIV阴性，年龄≥16岁），根据患者的临床表现、影像学检查、标本涂片抗酸染色、结核菌培养、组织病理学检查及对抗结核治疗的反应，将入选的患者最终归入预先定义的四组诊断：病原学，组织学确诊结核病、临床诊断结核病、结核病诊断不明及排除活动性结核病诊断。以患者最终诊断为依据，评价外周血T-SPOT.TB对活动性结核病的诊断价值。2）前瞻性纳入2008年6月至2010年3月在北京协和医院临床疑诊为结核性脑膜炎或以浆膜腔积液（胸腔积液，腹腔积液，心包积液，关节液）为主要表现，疑诊为结核性浆膜炎的107例住院病人（HIV阴性，年龄＞16岁）。同时进行外周血及浆膜腔积液，脑脊液的T-SPOT.TB检测。追踪患者，依据同样标准，将患者归为诊断活动性结核病、结核病诊断不明和排除活动性结核病三组。以患者最终诊断为依据，比较外周血及浆膜腔积液/脑脊液T-SPOT.TB以及TST对诊断结核性浆膜炎/脑膜炎诊断价值。3）横断面调查101名北京协和医院的医务工作者。既往无结核病史和胸片无陈旧结核改变。用以T细胞为基础的γ干扰素释放试验T-SPOT.TB及结核菌素皮试对比诊断潜伏性结核感染。4）应用MACS免疫磁珠分选去除外周血、胸水中CD4+T细胞，应用ELISPOT分析检测不同RD1基因编码抗原刺激后释放Y干扰素细胞频数在结核不同感染状态的变化；随诊治疗后的结核性浆膜炎/脑膜炎患者，探讨浆膜腔积液/脑脊液结核特异性T细胞随治疗的变化。
　　 结果：1）591例患者中9例失访,583倒患者获完整临床资料，其中47例病原学/组织学诊断结核病，95例临床诊断结核病，合计139例(23.9％)诊断为活动性结核病,46例(7.9%)临床诊断不明,398例(68.3%)排除活动性结核病诊断。外周血T-SPOT.TB诊断活动性结核病的敏感性为83.0%，特异性为65.0%，阴性预测值为91.6%，阳性预测值为45.3%。病原学/组织学确诊结核病患者中敏感性显著高于临床诊断结核病患者(95.7%vs76.4%，P=0.005)。Logistic回归分析显示，浆膜腔积液是影响外周血T-SPOT.TB敏感性的独立危险因素(RR=0.19，95%CI，0.07-0.53);非浆膜腔积液患者中外周血T-SPOT.TB敏感性为显著高于浆膜腔积液患者(90.4%vs71.4%，P=0.004)。临床诊断结核病组较病原学，组织学确诊结核病组，浆膜腔积液患者比例显著增高(45.7%vs23.4%，P=O.011)。既往结核病史或影像学陈旧结核表现是影响诊断特异性的独立危险因素(RR=0.54，95%CI，0.34-0.86)，既往有结核病史或影像学有陈旧结核改变患者特异性显著降低(47.2%vs71.0%，P=0.001)，诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为442SFCs/106PBMC，其中病原学/组织学确诊患者斑点形成细胞频数显著高于临床诊断患者(604SFCs/106PBMCvs276SFCs/106PBMC，P=0.033)。排除活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为124SFCs/106PBMC，显著低于活动性结核病患者(P＜0.001)。当外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞频数取界值72SFCs//106PBMC时，诊断活动性结核病的敏感性为71.9%，特异性为76.4%，ROC曲线下面积为0.810(95%CI，0.769-0.852)。当T-SPOT.TB斑点形成细胞数取值652SFCs//106PBMC时，诊断活动性结核病的特异性达95%。
　　 2)107例患者中32例诊断为结核性浆膜炎（其中7例病原学或组织学诊断）、36例排除结核性浆膜炎、12例诊断为结核性脑膜炎（3例病原学诊断）、14例排除结核性脑膜炎、8例未明确诊断、5例失访。在结核性浆膜炎患者中，外周血T-SPOT.TB的敏感性为78.1%；浆膜腔积液T-SPOT.TB的敏感性为96.9%，显著高于外周血(P=0.021)；二者均显著高于TST(37.5%)。外周血T-SPOT.TB的特异性为77.8%；浆膜腔积液T-SPOT.TB的特异性为88.9%，高于外周血，但统计学无显著差异(P=0.206)。浆膜腔积液T-SPOTTB的阳性预测值为88.6%，显著高于TST(52.9%，P=0.004)，但与外周血T-SPOT.TB(75.8%)相比，无显著差异。浆膜腔积液T-SPOT.TB的阴性预测值为97.0%，显著高于外周血(80.0%，P=0.030)，二者均显著高于TST。浆膜腔积液T-SPOTTB检测到释放Y干扰素的特异性T细胞频数显著高于外周血(1276[160-3648]vs456[244-744]，P=0.001)，当浆膜腔积液T-SPOT.TB的界值取60SFCs/106PEMC，诊断结核性浆膜炎的敏感性为90.6%，特异性为94.4%，阳性预测值为93.5%，阴性预测值为91.g%，ROC曲线下面积为0.974(95%CI，0.934-1.013)。在结核性脑膜炎患者中，外周血T-SPOT.TB的敏感性为91.7%，高于脑脊液T-SPOT.TB(58.3%)，二者均显著高于TST。脑脊液T-SPOT.TB的特异性及阳性预测值均为100%。3）101名医务工作者中T-SPOT.TB阳性29例(28.7%，95%CI19.9%-37.5%)，TST阳性53例(55.2%，95%CI64.0%-81.8%)。两种检测的一致性较差(57.3%，K=0.18，95%CI，0.01-0.52)。多因素分析显示暴露于菌阳肺结核患者是T-SPOT.TB阳性的危险因素(OR=3.68，95%CI，1.44-9.40)，而无因素与TST阳性结果相关。51名有菌阳肺结核暴露史的医务工作者中21例(41.2%，95%CI27.7%-54.7%)T-SPOT.TB阳性，明显高于50例无菌阳肺结核暴露史的医务工作者中的8例(16%，95%CI5.8%-26.2%，P=0.005)。前者ESAT-6和CFP-10肽段库合并的分泌IFN-y细胞频数是268SFCs/106PBMC(IQR90-522)，显著高于后者94SFCs/106PBMC(IQR40-231)(P=0.045)。4)四种结核RD1基因编码抗原ESAT-6、CFP-10、Rv3879c和11kD重组蛋白特异性T细胞数量在活动性结核病患者中高于潜伏性结核感染者；MACS免疫磁珠分选去除CD4+T细胞后，潜伏性结核感染者较活动性结核病患者中RD1基因编码抗原刺激后释放Y干扰素细胞下降明显；结核性浆膜炎/脑膜炎患者结核特异性T细胞向病变部位聚集；经抗结核治疗后，浆膜腔积液/脑脊液和外周血中结核特异性T细胞总体呈下降趋势，病变部位下降更加迅速。
　　 结论：1）外周血T-SPOT.TB诊断活动性结核病的敏感性较好，特异性低于结核低流行国家。有无浆膜腔积液是外周血T-SPOT.TB敏感性的独立影响因素；既往有无结核病史或影像学有无陈旧结核表现是外周血T-SPOT.TB特异性的独立影响因素。外周血T-SPOTTB阴性预测值较高(91.6%)，提示外周血T-SPOT.TB阴性结果对排除结核病价值较高；阳性预测值较低(45.3%)，提示在结核高流行地区，以24SFCs/106PBMC为临界值判断外周血T-SPOT.TB阳性结果对于活动性结核病的诊断价值较低。活动性结核病的斑点形成细胞数明显高于潜伏性结核或陈旧性结核感染，将界值斑点形成细胞数增加会提高T-SPOT.TB对活动性结核病诊断的特异性及阳性预测值。2）与外周血T-SPOT.TB的相比，浆膜腔积液T-SPOT.TB能够显著提高诊断结核性浆膜炎的敏感性：将界值提高至60SFCs/106PEMC时，能在不影响敏感性及阴性预测值的基础上，显著提高诊断结核性浆膜炎的特异性及阳性预测值。与外周血T-SPOT.TB的相比，脑脊液T-SPOT.TB能显著提高诊断结核性脑膜炎的特异性与阳性预测值。浆膜腔积液/脑脊液T-SPOT.TB对于结核性浆膜炎，脑膜炎的诊断具有较高的诊断价值，可以提高准确诊断结核性浆膜炎/脑膜炎水平。3）在综合医院医务工作者中应用T-SPOT.TB与TST对比诊断LTBI的研究发现T-SPOT.TB与TST结果的相关性较低。T-SPOT.TB结果与医务工作者是否有菌阳肺结核暴露史呈显著相关，TST结果与是否有菌阳肺结核暴露史不相关。TST阳性率明显高于T-SPOT.TB阳性率，其可能夸大了LTBI感染率。T-SPOT.TB检测为更准确诊断医务工作者LTBI提供了新的手段。4）在抗结核保护性免疫中，CD4+T细胞是释放IFN-Y，激活巨噬细胞的主要免疫细胞。活动性结核患者与潜伏性结核感染者相比，参与抗结核保护性免疫的细胞数量更多且种类更广。结核性浆膜炎/脑膜炎患者中，分泌IFN-Y的抗原特异性T细胞向病变部位聚集，随着有效的抗结核治疗，体内抗原量下降，分泌IFN-Y的结核分枝杆菌RD1基因编码抗原特异性T细胞总体呈现下降趋势，且病变部位下降更加迅速。