核基质结合蛋白SATB2调控Gγ和Aγ珠蛋白基因表达的空间靠近

摘要

真核基因表达调控是发生在细胞核内的一个复杂而精细的过程，对维持细胞乃至机体的正常生理功能起到至关重要的作用。其中，染色质水平的调控作为真核基因表达调控的一种重要方式日益受到人们的重视。核基质结合蛋白是一类重要的真核基因转录调控因子，它们定位到细胞核内的核基质结构上，与大量调控相关的转录因子和酶类形成复合物，并参与基因的活化或抑制。目前已经发现的核基质结合蛋白有很多，包括SAF-A，Cux/CDP，SATB1，SATB2等。其中，SATB1和SATB2是属于SATB家族的一类经典的核基质结合蛋白，它们可以结合到基因调控序列的AT富含区从而调控染色质的结构。
　　 珠蛋白基因簇的表达调控是研究真核基因转录调控的经典模型。人珠蛋白基因簇由上游的一系列超敏位点组成的基因座控制区(locus control region，LCR)和下游的胚胎期(ε)、胎儿期(γ)和成年期(β)珠蛋白基因组成。在珠蛋白基因簇活化时上游基因座控制区会与下游活性基因空间靠近形成活性染色质中心。已有研究表明SATB1在人β珠蛋白基因簇上有多个结合位点，并转录调节胚胎期珠蛋白基因的表达以及通过促进结合位点间的靠近来调控β珠蛋白基因簇的整体空间结构。
　　 在本研究中，我们利用人γ珠蛋白基因启动子的AT富含区作为探针，捕获到核基质结合蛋白SATB2的结合。这段序列曾被发现具有结合SATB1的能力，但这种结合未在体内证实。进一步对SATB2的表达进行研究发现其在K562细胞和人脐血造血干细胞红系分化期间持续表达，并主要在小鼠发育早期阶段表达。
　　 通过体内和体外的结合实验，我们证实SATB2可以特异地结合在Gγ和Aγ珠蛋白基因的启动子上游区域且前者结合力较强。通过将Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区构建到报告基因的载体中进行实验，我们发现SATB2可以反式增强Gγ和Aγ启动子的活性。我们在K562细胞中分别过表达和干扰了SATB2蛋白，发现SATB2对γ珠蛋白基因起激活的作用。我们还检测了组蛋白修饰和RNA聚合酶Ⅱ的募集，发现染色质结构的变化与基因表达变化是一致的。我们进一步在人脐血来源的造血祖细胞中过表达和干扰了SATB2蛋白并诱导其向红系分化，证实了SATB2对γ珠蛋白基因的激活作用。
　　 我们进一步研究SATB2激活γ珠蛋白基因的分子机制。我们发现组蛋白乙酰化酶PCAF可以与SATB2相互作用并促进其反式激活能力，并被SATB2募集到γ珠蛋白基因启动子上。通过SATB2的串联亲和纯化实验我们发现SATB2与SATB1通过各自的PDZ蛋白区域相互作用，提示二者可能协同促进β珠蛋白基因簇的活性空间构象的组织。染色质构象捕获技术(chromosome conformation capture，3C)发现，SATB2可以促进Gγ和Aγ基因启动子区域的空间靠近，但并不影响其它元件所在染色质区域的空间靠近，说明SATB1和SATB2两个蛋白在β珠蛋白基因簇的调控中具有分工。ChIP-3C的实验证明这种空间靠近是SATB2蛋白介导的。进一步的蛋白质免疫共沉淀实验证明SATB2蛋白具有分子间自身相互作用，这种自我相互作用可能就是SATB2介导染色质靠近的原因。
　　 综上所述，我们的研究说明在红系细胞中，SATB2通过结合在Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区的AT富含区上，募集组蛋白乙酰化酶，促进γ珠蛋白基因的表达和染色质的活化，并促进Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区的空间靠近。本研究进一步丰富了SATB1介导的MAR元件空间靠近的结构，同时也为深入了解β珠蛋白基因簇活性染色质中心的结构提供了实验依据。

目录

摘要

前言

一、组蛋白修饰和高级染色质空间结构是真核基因表达调控的重要方式

1 染色质水平的调控是真核基因表达调控的重要方式

2 组蛋白修饰和高级染色质空间结构是染色质水平调控的重要方式

二、核基质结合蛋白结合MAR元件并参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构

1 MAR元件参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构

2 SATB1在胸腺细胞调控基因转录并组织染色质空间结构

3 SATB2在前B细胞和成骨细胞调控基因转录

三、真核基因表达调控经典模型β珠蛋白基因簇的染色质结构受到核基质结合蛋白的调节

1 β珠蛋白基因簇由上游LCR元件和下游具有发育阶段特异表达的珠蛋白基因组成

2 β珠蛋白基因簇开放时超敏位点和下游基因发生空间靠近形成活性染色质中心

3 核基质结合蛋白SATB1调节ε珠蛋白基因的表达并调控整个基因簇的空间结构

四、本研究的理论依据与实验设计

材料与方法

一、实验材料

1 菌株与质粒

2 细胞系及实验用小鼠

3 限制性内切酶及修饰酶

4 抗体

5 引物合成

6 其它主要试剂和材料

7 主要仪器设备

二、实验方法

1 本研究的基本技术路线

2 细菌操作与质粒的转化

3．实验中所用细胞的培养和处理

4 小鼠胚胎组织分离

5 定量和半定量RT-PCR

6 Western-Blotting

7 双荧光素酶报告系统检测

8 免疫荧光

9 蛋白质免疫共沉淀和串联亲和纯化

10 凝胶电泳阻滞实验(EMSA)分析

11 生物素标记DNA沉淀实验

12 染色质免疫沉淀(ChIP)

13 染色质构象捕获技术(3C)

14 染色质免疫共沉淀与3C方法联合(ChIP-3C)

实验结果

一、红系细胞中表达的核基质结合蛋白SATB2具有γ珠蛋白启动子MAR元件的结合能力

1 生物素标记DNA探针沉淀法检测到SATB2具有结合在γ珠蛋白启动子MAR元件的能力

2 SATB2在人胚胎胎儿期红系分化过程中持续表达并主要在小鼠发育早期表达

二、SATB2特异结合到Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子MAR元件上

1 K562细胞中SATB2特异结合到Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子上

2 EMSA实验中SATB2可以特异结合到Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子的MAR元件上

三、SATB2在K562细胞和人原代红系分化细胞中激活人γ珠蛋白基因表达

1 SATB2对人γ珠蛋白基因启动子具有反式激活能力

2 K562细胞中SATB2上调人γ珠蛋白基因表达

3 SATB2在人原代红系分化细胞中上调人γ珠蛋白基因表达

四、PCAF增强SATB2对人γ珠蛋白基因的激活作用

1 K562细胞中SATB2和PCAF相互作用

2 PCAF促进SATB2的反式激活能力

3 SATB2增加了PCAF在人γ珠蛋白基因启动子上的募集

4 串联亲和纯化法发现SATB2的相互作用蛋白SATB1等

五、SATB2促进人Gγ与Aγ珠蛋白基因间的空间靠近

1 SATB2介导人γ珠蛋白基因启动子间的空间靠近

2 SATB2具有分子间自我相互作用

讨论

一、核基质结合蛋白SATB1和SATB2参与基因转录调控

二、SATB2在红系细胞中表达并调控γ珠蛋白基因表达

1 SATB2在红系细胞中表达

2 SATB2直接激活γ珠蛋白基因表达

3 SATB2可募集辅因子PCAF参与其反式激活作用

三、SATB2介导珠蛋白基因簇内Gγ和Aγ珠蛋白基因的空间靠近

1 珠蛋白基因簇活化时具有活性染色质中心结构

2 SATB2介导活性染色质中心内MAR元件的靠近

3 SATB2介导MAR元件的靠近可能是基因表达上调的重要因素

四、SATB1和SATB2对染色质高级结构组织中的协同分工

1 SATB1和SATB2在Xist RNA的沉默功能和在ES细胞分化过程中的作用

2 SATB1和SATB2在珠蛋白基因调控中具有协同与分工

3 SATB1和SATB2可能形成同源／异源多聚物参与基因表达调控和染色质空间结构组织

五、“活性G／Aγ-MAR靠近”模型

六、本研究的不足与展望

小结

参考文献

综述

英文名词及缩写

致谢

个人简历

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