先天性小耳畸形残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养构建组织工程软骨的实验研究

摘要

第一部分残耳软骨细胞诱导脂肪干细胞向软骨分化的实验研究
　　 目的：研究ADSCs的体外生长的生物学特性及其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。
　　 方法：利用先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织与脂肪组织,胶原酶消化法从组织中提取脂肪干细胞,体外传代培养及生物学特性研究:细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志物,多向分化诱导检测,其向软骨、骨、脂肪及内皮多向分化诱导能力检测。胶原酶消化法从组织中提取残耳软骨细胞、脂肪干细胞,脂肪干细胞与残耳软骨细胞隔离共培养,检测残耳软骨细胞微环境能否诱导脂肪干细胞向软骨方向分化:Alcian Blue染色；RT—PCR检测CollagenⅡ基因及Aggrecan基因的表达。
　　 结果：ADSCs呈成纤维细胞样生长,生长旺盛；流式细胞仪检测显示:CD44,CD105阳性,CD34,CD45,CD106,CD117为阴性；成骨诱导茜素红染色显示钙化基质沉积表达；成脂肪诱导油红-0染色阳性,胞浆内见脂滴形成；成软骨诱导细胞聚集成小团块,番红0染色显示蛋白聚糖表达阳性。
　　 结论成功分离培养出脂肪干细胞,ADSCs生长增殖能力强,高表达干细胞相关抗原,可长期传代,具有多向分化潜能可向软骨,骨,脂肪等多个方向分化,可作为组织工程软骨构建的种子细胞。残耳软骨细胞能够在体外模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs向软骨分化。
　　 第二部分残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究
　　 目的：残耳软骨细胞与ADSCs在裸鼠体内构建组织工程软骨最佳细胞比的初步研究。
　　 方法：实验分组:第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs以1:9的比例混合作为实验组(Exp1),以3:7的比例混合作为实验组(Exp2),以5:5的比例混合作为实验组(Exp3),单纯残耳软骨细胞作为阳性对照组(Ctrl.1),单纯ADSCs作为阴性对照组(Ctrl.2),Exp1、Exp2、Exp3、Ctrl.1和Ctrl.2组接种细胞终浓度为5.0×107/ml,单纯低密度残耳软骨细胞对照组(Ctrl.3)细胞终浓度为2.5×107/ml。每组按各自的细胞浓度将0.2ml的细胞量与Pluronic—F127复合物混合后注射到裸鼠背部皮下,每组接种6只裸鼠。体内培养10周后取材,通过对新生组织的大体观察、湿重比较、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色检测以及Realtime PCR检测相关基因表达,初步找到体内构建组织工程软骨残耳软骨细胞与ADSCs之间的最佳比例。
　　 结果：Exp2、Exp3组与Ctrl.1组注射部位形成白色软骨样组织,3组新生组织的大小相仿,外观和弹性与正常软骨相似；Ctrl.2组形成纤维样组织,质软,色淡黄；Exp1.、Ctrl.3组形成的软骨样组织表面光泽度及弹性差,新生组织量也明显较Exp2、Exp3组与Ctrl.1组少。Exp2、3组平均湿重分别达到达到Ctrl.1组的87％及88.7％；Exp1、Ctrl.3组平均湿重分别低于Ctrl.1组平均湿重的33％及40％；Exp2、Exp3组平均GAG含量达到Ctrl.1组的90％以上；Exp2、Exp3组和Ctrl.1组的平均湿重和GAG平均含量均显著高于Exp1、Ctrl.2组和Ctrl.3组(P<0.05)。组织学染色:Exp1、Exp2、Exp3组、Ctrl.1组与Ctrl.3组标本均有软骨陷窝形成,Exp1、Ctrl.3组与Exp2、Exp3、Ctrl.1组相比较,软骨陷窝松散排列不均,软骨陷窝较大；Ctrl.2组为纤维样组织,未见软骨陷窝形成。Ⅱ型胶原免疫组化染色:Exp1、Exp2、Exp3组、Ctrl.1组与Ctrl.3组标本均可见成熟软骨陷窝周围有不同程度的棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达；Ctrl.2组未见Ⅱ型胶原表达。共移植组(Exp2)和共移植组(Exp3)在相关基因表达方面与阳性对照组(Ctrl.1)相近似(p>0.05),而ADSCs对照组(Ctrl.2)及低密度残耳软骨细胞对照组(Ctrl.3)以及共移植组(Exp1)与阳性对照组(Ctrl.1)在相关基因表达方面差异较明显(p<0.05)。
　　 结论：残耳软骨细胞与ADSCs在裸鼠体内构建组织工程软骨的上述三个比例中,3:7为最佳比例。