间充质干细胞用于实体组织治疗的潜在机制分析及在肺照射损伤模型中的应用

摘要

肺纤维化是多数肺组织损伤及病变发展到末期的共同特点,目前临床对其尚缺乏有效的治疗手段,常用激素等药物对症治疗,但疗效欠佳。由于肺纤维化由肺上皮细胞及肺固有干细胞衰竭引起,近年来,随着干细胞研究的深入发展,以间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为代表的干细胞移植治疗肺纤维化在动物实验中取得了部分有效结果,但其有效性和治疗机制至今并没有完全阐明。
　　 本实验选择胸腔照射引起的肺纤维化小鼠模型,研究MSC治疗的潜在机制,分别从供体细胞的植入和分化、输注治疗时间窗、MSC的非替代修复三方面对细胞的潜在治疗机制进行了分析,同时选取相应的实体组织损伤模型进行比对研究。并在此基础上,进一步探索转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1在肺纤维化及MSC移植治疗中的作用,从而提出扩大治疗时间窗的临床应用新策略。
　　 本课题的第一部分,我们首先研究了MSC的分化潜能。体内、外分化实验证实MSC具有向肺上皮和血管内皮等功能性细胞分化的潜能,在小鼠受到照射损伤后移植细胞可改善其晚期肺纤维化的症状。然而,在定向损伤耳膜毛细胞的药物性致聋小鼠模型进行MSC移植治疗研究中发现,尽管供体细胞可定向分化为内耳毛细胞样细胞,但并没有改善小鼠听力功能。提示MSC具有向组织细胞定向分化并替代损伤组织细胞的潜能,但是仅依赖于替代修复机制不能恢复受损组织功能,同时,现有的有效治疗方案中MSC移植仅选择在损伤后立即进行,对于慢性病变模型中MSC的疗效缺乏评估。
　　 在本课题的第二部分,我们进一步观察肺照射损伤后不同时间点输注MSC对肺纤维化的治疗效果。结果表明,在肺放射损伤急性期移植的MSC可分化为多种肺功能细胞(包括肺泡上皮、支气管上皮和血管内皮等),显著改善照射损伤小鼠的纤维化症状,延长模型鼠生存期。而中晚期移植的MSC则基本分化为肌成纤维细胞,参与纤维化进程。同时我们采用骨骼肌慢性病变(杜氏肌营养不良,DMD)的mdx小鼠作为对照模型进行对比研究,结果发现,在药物损伤骨骼肌后植入MSC可有效改善DMD的特异病理指标,而在不进行人为损伤的情况下,发病早期反复输注MSC可有效改善DMD的特异病理指标。而病变中晚期移植则疗效欠佳。提示供体细胞的植入需要机体微环境的支持。同时,慢性疾病或损伤后慢性组织改变均存在进一步扩大“治疗窗口期”的可行性,但是进入坏死、钙化和纤维化的晚期病变组织基本难以逆转。
　　 在研究的第三部分,通过对体内炎症因子表达量检测发现,在肺照射损伤后各个时期输注的MSC均可在短时间内抑制炎症反应,且调控TH1/2平衡向TH2偏移,这可能是早期移植有效的重要机制。在对照实验——小鼠肾缺血模型中,MSC移植能够改善缺血再灌注后引起的肾脏损伤,减少纤维化的产生。其机制可能是通过促进肾内固有细胞增殖,促进损伤的肾小管上皮细胞BMP7高表达,进而推动肾脏内源性修复发挥治疗作用。上述结果提示,对炎症的抑制和对固有细胞自我修复的支持可能是MSC治疗的两个重要机制。
　　 对前三部分的研究结果进行总结发现,MSC可能通过分化替代和抑制炎症等机制对实体组织病变起到治疗作用,MSC在组织受损后中晚期移植不具疗效可能与MSC在微环境的作用下发生改变相关。因此,论文第四部分对纤维化和MSC的关键性调控因子--转化生长因子(transforming growth factor,TGF-β1)进行了研究,以进一步优化MSC治疗的策略。结果表明,肺照射损伤后不同时间点TGF-β1水平的动态改变可能是不同时间点移植的MSC在受体内分化方向差异的直接影响因素。在体外实验中,TGF—β1与照射后纤维化期的肺组织环境均可直接抑制MSC向上皮分化,并刺激MSC大量增殖、活化为肌成纤维细胞。通过中和抗体或小干扰RNA(siRNA)阻断TGF-β1通路后,纤维化期肺组织环境中的MSC在细胞因子的作用下可部分向上皮分化。进一步进行体内实验发现,MSC移植与TGF-β1中和抗体配合使用可将小鼠照射模型中MSC移植的有效治疗时间延长到照射后慢性炎症期,是一种极具前景的治疗新策略。