鸡抗EV71卵黄抗体制备及其抗病毒作用研究甲型H1N1流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响研究 季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及潜在分子机理研究

摘要

人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)已被确认为是手足口病的主要病原体之一,它所具有的嗜皮肤性和嗜神经性,严重威胁婴幼儿的健康,但目前缺乏特异、高效的抗病毒药物。许多科技工作者正在研发各种类型的EV71疫苗,包括灭活疫苗、类病毒颗粒疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗,但疫苗的研究刚刚起步,尚处在动物实验阶段,远没有达到临床应用的要求。EV71病毒抗体与人脑组织免疫交叉机制的发现,推测疫苗直接免疫人体可能会引发神经毒副反应。所以,探索一个能够口服且无副作用的治疗方法迫在眉睫。本课题研究外源给予的,不对人体直接免疫,口服卵黄抗体的治疗方法,来防治手足口病。卵黄抗体(IgY)指特定抗原免疫蛋鸡后从鸡蛋中提取的针对特定抗原的抗体,是生物科学研究领域的一项重大发现。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来,卵黄抗体的研究不断深入,目前,卵黄抗体已被广泛应用于许多疾病的防治。受此启示,本课题采用EV71灭活病毒作为抗原分五次免疫母鸡,水稀释法提取卵黄抗体,ELISA方法检测抗体滴度,结果显示EV71卵黄抗体效价在第二次免疫后明显升高,在第三次免疫后一周达最高峰；通过病毒中和实验对抗体的抗病毒作用进行了研究,第三次免疫后1周卵黄抗体的中和指数是26.6,表明卵黄抗体在细胞水平具有良好的抗病毒作用,且该抗体对4种不同来源的C4亚型毒株均具有不同的抗病毒作用。我们的研究证实90％蛋鸡经免疫后均可产生中和指数大于24的中和抗体,可以用于大规模生产。由此可见鸡免疫EV71后,可产生具有良好体外抗病毒效果的卵黄抗体。而且卵黄抗体具有取材方便、提取方法比较简单、产量高等优点,实验条件简单,适合大规模生产。本研究为手足口病重点防治及重症患者的急救提供了抗体治疗的思路。2009年4月,始发于墨西哥和美国的流感,是由一种新型甲型H1N1流感病毒引起的急性热性呼吸道传染病,短短数月,疫情蔓延全球,但在不同地区报道的重症患者和病死率有较大差异,可能与病毒基因多态性有关,因此,本文研究2009年甲型H1N1流感病毒基因序列多态性对病毒复制及毒力的影响。病毒复制分析在MDCK细胞中进行,毒力和致病性实验在BALB/c小鼠体内进行。选择A/California/04/2009,A/Sichuan/1/2009和A/Beijing/3/2009三株病毒,分别感染MDCK细胞,48小时后A/Sichuan/1/2009病毒株的病毒RNA载量显著高于其他两株(P<0.05)；同时滴鼻接种BALB/c小鼠,观察发病情况及存活率,观察期为14天,80%的小鼠在接种A/Sichuan/1/2009病毒后死亡,A/California/04/2009毒株感染后的存活率是60%,A/Beijing/3/2009病毒株感染后没有出现死亡小鼠。感染后5天,当病毒扩散达高峰时,接种A/Sichuan/1/2009株病毒液的小鼠肺组织病毒RNA载量显著高于其他两种毒株(P<0.05)；通过切片、HE染色、镜下观察,三种毒株感染小鼠的肺组织均有充血、出血、水肿、渗出等炎症病理变化。接种A/Sichuan/1/2009病毒株的小鼠,100%肺组织出现病变,接种A/California/04/2009病毒株的小鼠85%肺组织出现病变,接种A/Beijing/3/2009病毒株的小鼠肺组织出现病变的发生率是60%。另一方面,对三株病毒的全基因组进行测序及序列比对,对其基因突变情况及多态性进行分析。A/Sichuan/1/2009株全基因中有5个氨基酸发生了突变,其中PA蛋白中343位点的A突变为T,PB1蛋白中353位点的K突变为R,566位点的T突变为A,PB2蛋白中471位点的T突变为M,对病毒毒力的增强起重要作用。在本研究中,体内和体外实验表明全基因组序列的多态性可能是决定2009年甲型H1N1流感病毒复制能力,毒力,及致病性不同的关键因素之一。2009年8月,根据香港最新的流感流行病学调查,H1N1亚型流感病毒占全部人际间流行株的49%,显示该病毒已成主流流行株。因此,建立H1N1流感病毒感染的动物模型,尤其是从经济角度及遗传背景角度最优的BALB/c小鼠模型,对于疾病机理的深入研究及新药和疫苗的临床前检定都具有非常重要的意义。然而,野生型季节性流感病毒H1N1通过常规接种方式并不能感染小鼠,但研究发现通过将低毒力的病毒对小鼠肺组织进行连续传代,有望获得毒力显著增强的鼠肺适应株病毒。本实验用毒力较弱的野生型季节性流感H1N1病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株及重症感染模型。季节性流感H1N1A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%。对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变,最主要的是第89个位点上Thr至Ile氨基酸的改变。本实验对导致毒力增强的分子机制进行了研究,为季节性流感病毒致病机理的深入研究,尤其是流感病毒的跨物种传播机制,以及在此过程中所发生的环境选择压力下流感病毒的分子进化行为均可提供重要的理论指导,同时基于鼠肺适应株建立的重症小鼠感染模型对于相关新药和疫苗的临床前评价都具有广阔及重要的实际应用价值。