HRSV纯化条件的探索及实验性疫苗免疫原性的初步评价

摘要

人类呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是世界范围内引起各年龄组下呼吸道感染的重要病毒病原体之一,尤见于婴幼儿、老年人和免疫抑制个体,但临床上至今尚无安全有效的疫苗。本课题的研究目的是筛选出一种或几种HRSV的理想纯化方法,并对不同纯化产物进行免疫原性评价,为HRSV裂解纯化疫苗的研制积累一定的基础资料。研究内容主要包括:HRSV在人二倍体KMB17细胞上的大量繁殖、病毒收获液的超滤浓缩、HRSV不同方法的纯化和纯化条件的探索,以及纯化产物的免疫原性评价,并对灭活剂、佐剂和免疫程序等免疫原性的影响因素进行探索。
　　 使用细胞工厂和罗氏瓶两种容器培养HRSV,两者均可获得较高感染性滴度的病毒。细胞工厂培养HRSV的最佳条件还需进一步探索。
　　 将病毒收获液以100kD滤膜包超滤浓缩30倍和103倍后,分别使用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析法进行纯化,并对纯化产物进行感染性滴度检测、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot鉴别。经还原电泳,2种纯化方法制备的纯化产物都在60～70kD间呈现一主要条带,Western blot证实为HRSV特异性F蛋白。结果表明Sepharose4FF凝胶过滤层析法比蔗糖密度梯度离心法更适合于HRSV的纯化,效果更好、效率更高。但柱体积、上样量、洗脱流速等条件会对纯化效果产生影响。
　　 将蔗糖密度梯度离心和Sepharose4FF凝胶过滤层析2种方法纯化HRSV所得样品免疫ICR小鼠,抗体阳转率相同,中和抗体几何平均效价(GMT)相近,虽然免疫剂量不同(前者的病毒蛋白含量是后者的2.5倍),但二者的免疫原性无统计学差异,说明Sepharose4FF凝胶过滤层析法纯化产物的免疫原性较高。
　　 在纯化样品的免疫原性影响因素的探索中,甲醛灭活组的抗体阳转率和中和抗体GMT都比β-丙内酯灭活组的高；铝佐剂对实验性疫苗的免疫原性影响不大；虽然0d、7d、14d和0d、28d两个免疫程序均能诱导相对较高的中和抗体水平(1:9.51～1:11.31),但结果提示多针免疫有助于提高抗体阳转率和中和抗体效价。