嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中多个肿瘤抑制基因异常甲基化的研究

摘要

第一部分嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中多个肿瘤抑制基因DNA甲基化研究
　　 目的:
　　 良恶性嗜铬细胞瘤(PHEO)和副神经节瘤(PGL)的鉴别以及恶性嗜铬细胞瘤的有效治疗是目前神经内分泌肿瘤研究中尚未解决的难题。表观遗传学是目前研究肿瘤及疾病发生中除遗传学改变外的另一个重要领域。对嗜铬细胞瘤的表观遗传学研究国外才刚刚开始,故本研究选择与细胞周期调控有关的基因p16INK4a,DNA修复相关的基因hMLH1、MGMT、BRCA1,ras相关信号传导途径的RASSF1A基因,细胞凋亡相关的DcR2基因,基因突变导致嗜铬细胞瘤发生的SDHB、SDHD、VHL基因以及本课题组前期研究中显示在嗜铬细胞瘤中低表达的LRP1B基因用表观遗传学中的甲基化特异性PCR方法(MSP)研究上述基因的甲基化状态,寻找嗜铬细胞瘤CpG岛甲基化表型；分析基因甲基化改变与患者肿瘤良恶性及其他临床特征之间的关系。
　　 方法:
　　 1.用E.Z.N.ATM DNA/RNA Isolation Kit提取24例PHEO(10例恶性,14例良性)、29例PGL(14例恶性,15例良性)和7例正常肾上腺髓质的组织DNA；
　　 2.甲基化特异性PCR方法检测不同组织中p16INK4a、RASSF1A、DcR2、MGMT、SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLH1基因的甲基化状态,探讨PHEO和PGL中上述基因DNA甲基化改变；
　　 3.分析患者基因启动子区甲基化状态与肿瘤良恶性及其他临床资料的关系,了解其在PHEO和PGL中的病理生理意义。
　　 结果:
　　 1.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因在PHEO和PGL中的甲基化改变
　　 1)在53例PHEO/PGL组织中分别检测到p16INK4、RASSF1A、MGMT、DcR24个基因的甲基化,检出率为52.8％、52.8％、35.8％、60.4％。在PHEO中4个基因甲基化检出率分别为58.3％(14/24)、58.3％(14/24)、41.7％(10/24)、54.2％(13/24),其中恶性分别为33.3％(8/24)、25.0％(6/24)、20.8％(5/24)、20.8％(5/24)；在PGL中4个基因甲基化检出率分别为48.3％(14/29)、48.3％(14/29)、31.0％(9/29)、65.6％(19/29),恶性分别为37.9％(11/29)、34.5％(10/29)、20.7％(6/29)和48.3％(14/29)；
　　 2) p16INK4基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为42.9％(6/14)、80.0％(8/10)、20.0％(3/15)及78.6％(11/14);
　　 3) RASSF1A基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为57.1％(8/14)、60.0％(6/10)、26.7％(4/15)及71.4％(10/14);
　　 4) MGMT基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为35.7％(5/14)、50.0％(5/10)、20.O％(3/15)及42.9％(6/14);
　　 5) DcR2基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为57.14％(8/14)、50.00％(5/10)、33.33％(5/15)及100％(14/14);
　　 6)恶性PHEO和PGL中至少有一个基因发生甲基化,而在良性肿瘤中有8例标
　　 本(1例PHEO,7例PGL)4个基因均未发生甲基化。CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性者19例,包括5例恶性PHEO、4例良性PHEO；9例恶性PGL,1例良性PGL。
　　 2.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因甲基化的临床意义
　　 1)恶性PGL患者24h尿去甲肾上腺素(NE)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平高于良性患者,差异有统计学意义(p<0.05)。
　　 2) PHEO中p16INK4a基因甲基化的患者24h尿肾上腺素(E)高于非甲基化者,差异有统计学意义(p=0.014)。
　　 3) PGL中,p16INK4a基因甲基化多见于恶性患者(vs良性),差异具有显著的统计学意义(p=0.002),有多见于发病年龄小的趋势,但差异无统计学意义(p=0.085)。RASSF1A基因甲基化多见于恶性患者(vs良性),差异具有显著的统计学意义(p=0.016)。DcR2基因甲基化多见于恶性患者、发病年龄小的患者,差异具有显著的统计学意义(p<0.01)。
　　 4)甲基化指数(MI)在恶性PGL患者明显高于良性患者,具有显著的统计学差异(p<0.001)。CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性亦多见于恶性PGL患者,与良性患者相比差异具有显著的统计学意义(p=0.002)。
　　 3.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因甲基化的相关性分析
　　 1) PHEO中RASSF1A与DcR2基因甲基化具有相关性(r=0.410,p<0.05)。
　　 2) PGL中p16INK4a与DcR2基因甲基化具有相关性(r=0.556,p<0.01)；RASSF1A与MGMT、DcR2基因甲基化具有相关性(r=0.396,p<0.05和r=0.411,p<0.05)。
　　 4.SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLH1基因在PHEO和PGL中的甲基化改变
　　 未检测到该6个基因DNA甲基化改变。
　　 结论:
　　 1.84.9％(45/53)的PHEO和PGL中至少有p16INK4a、RASSF1A、DcR2、MGMT四个基因中的1个以上发生启动子区甲基化,提示上述肿瘤抑制基因DNA甲基化在PHEO和PGL的发生发展中起重要作用；
　　 2.p16INK4a、RASSF1A、DcR2基因甲基化均与PGL的恶性行为有关,提示p16INK4a、RASSF1A、DcR2基因启动子区的甲基化状态可作为鉴别良恶性PGL的实验室依据,对甲基化阳性的患者应进行密切随访观察。
　　 3.甲基化指数(MI)及CpG岛甲基化表型(CIMP)均与PGL的恶性程度有关,提示恶性PGL中有多个肿瘤抑制基因高甲基化水平,检测多个基因启动子区的甲基化状态对于鉴别PGL的良恶性具有一定的指导意义。