转移相关基因在人非小细胞肺癌中的表达及其对肿瘤生物学行为的影响

摘要

肺癌是目前世界上对人类健康威胁最大的肿瘤。随着现代医学科学研究成果在肺癌治疗领域的广泛应用,近年来肺癌的综合治疗水平有了很大进步。但非常遗憾的是,肺癌患者的长期生存率仍然徘徊不前。肺癌尤其是非小细胞肺癌使用目前的治疗手段难以根除,肿瘤易转移和复发,其术后生存率低、中位生存时间短,术后生活治疗差。治疗肺癌最大的困难在于对其发病机制的研究无重大进展,因此深入揭示肺癌尤其是非小细胞肺癌发生的分子病理学机制,阐明决定肺癌恶性生物学行为的关键基因及其作用机制具有重要的科学意义。
　　 细胞恶性增殖、凋亡失衡并发生侵袭和转移是肿瘤最重要的生物学特征,也是肿瘤形成和发展的重要机制,这些特征的出现涉及多个基因的改变,并接受复杂的信号转导网络系统的调节。转移相关基因(metastasis—associated gene,MTA)家族包括MTA1、MTA2、MTA3三个主要成员。最近的研究表明,MTA家族尤其是MTA1具有促进恶性增殖的作用,并在肿瘤血管生成以及侵袭和转移过程中扮演重要角色。MTA在人类多种常见肿瘤中存在高表达,提示MTA与多种人类肿瘤的形成和发展有密切关系。
　　 目前,国内外有关MTA家族与肺癌发生发展关系研究的较少,MTA家族成员在肺癌肿瘤恶性增殖、抗凋亡以及血管生成中的作用尚不完全清楚。基于以上分析,本课题从以下四个方面进行研究:
　　 第一部分MTA家族成员mRNA在人非小细胞肺癌组织表达及意义。
　　 使用荧光定量PCR法检测中国汉族人群中非小细胞肺癌原发灶、正常肺组织及肿瘤细胞系中MTA家族基因mRNA表达状况,分析MTA家族基因mRNA表达水平与人非小细胞肺癌临床病理学特征的关系(包括:患者年龄、性别、病理分期、肿瘤分期和淋巴结分期、病理类型及分化程度)。结果显示:虽然MTA1基因的mRNA在人肺癌组织和正常肺组织中均有表达,但是肺癌组织中表达量明显高于正常肺组织中的表达量,MTA1基因的mRNA在肿瘤组织中高表达率与肿瘤分期和淋巴结分期相关,与患者年龄、性别、组织类型和分化程度等临床病理学特征无关.而且MTA1基因的mRNA在人肺癌A549和SK—MES—1细胞中的表达量较高。以上结果提示MTA1基因可能与肺癌的发生和进展有关。MTA2基因的mRNA在人肺癌组织和正常肺组织中均有表达,但是肺癌组织中表达量明显高于正常肺组织中的表达量,MTA2基因的mRNA在肿瘤组织中高表达率与肿瘤分期和淋巴结分期相关,与患者年龄、性别、组织类型和分化程度临床病理学特征无关。
　　 以上结果提示MTA2基因可能与肺癌的发生和进展有关。MTA3基因的mRNA在人肺癌组织中表达阳性率为60％,在正常肺组织中表达阳性率为40％,在人肺癌组织中和正常肺组织中表达阳性率有明显差别。MTA3基因的mRNA在人肺癌组织中的表达与患者年龄、病理分期有关与患者性别、肿瘤组织类型和分化程度无关。结果提示:MTA1、MTA2和MTA3基因的mRNA在人非小细胞肺癌组织中表达上调,与肺癌的发生和发展密切相关。
　　 第二部分MTA1蛋白表达与人非小细胞肺癌临床病理学特征、增殖及血管形成的关系。
　　 使用免疫组织化学法检测中国汉族人群中非小细胞肺癌原发灶、正常肺组织中MTA1蛋白表达状况,分析MTA1蛋白表达水平与人非小细胞肺癌临床病理学特征的关系(包括:患者年龄、性别、病理类型及分级、病理分期等)。进一步使用免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGF)及CD34在人非小细胞肺癌中的表达,评估MTA1蛋白表达人非小细胞肺癌增殖及血管形成的关系。结果显示:MTA1蛋白在正常肺组织中未见明显表达。在人非小细胞肺癌组织中表达升高,而且其表达与肿瘤病理分期和淋巴结转移相关,与非小细胞肺癌的其它临床病理学特征(患者年龄、性别、N分期、肿瘤病理组织学类型)无明显关系。MTA1蛋白表达阳性的肺癌组织中PCNA表达明显增高,增殖指数增高,说明TA1蛋白表达阳性肺癌细胞增殖活跃。MTA1蛋白表达阳性的病例肺癌组织中微血管密度明显高于MTA1蛋白表达阴性的肺癌病例。进一步研究显示,MTA1蛋白表达阳性的肺癌组织中VEGF表达高于MTA1蛋白表达阴性的肺癌,相关检验证明两者表达具有相关性,说明MTA1可能通过VEGF促进肿瘤血管生成。
　　 结果提示:MTA1参与肺癌的发生与进展,与肿瘤细胞恶性增殖有关,可能是肺癌细胞恶性增殖的促进因素之一；MTA1蛋白可能与肺癌血管新生有关,其可能是促进肿瘤微血管生成的因素之一,可能通过VEGF促进肿瘤血管生成。
　　 第三部分hMTA1-shRNA慢病毒载体的构建与鉴定。
　　 针对MTA1基因设计4对发夹式siRNA模板,并构建到慢病毒真核表达载体中,形成重组载体；PCR扩增MTA1基因并与pEGFP—N1-3FLAG真核表达载体构建MTA1基因的过表达载体。慢病毒重组载体与MTA1基因的过表达载体共转染293T细胞,利用RNAi来阻断MTA1基因的表达以筛选有效靶基因序列。观察慢病毒载体的转染效率,使用Western blot检测共转染后MTA1基因蛋白表达的变化,MTA1基因蛋白表达下降最明显的序列为最佳干扰序列。根据筛选结果制备hMTA1-shRNA慢病毒载体,为下一步研究重组慢病毒载体的RNAi干扰效应奠定基础。
　　 第四部分hMTh1-siRNA慢病毒载体RNA干扰MTA1基因对人肺癌细胞系影响的体外实验研究。
　　 使用hMTA1-siRNA慢病毒载体分别转染人肺癌A549和sK-MES—1细胞,观察转染效率及转染对MTA1基因表达的影响,建立稳定转染的细胞系。进一步通过MTT法绘制生长曲线,观察MTA1基因表达抑制对人肺癌A549细胞系体外增殖能力的影响；并使用TRANSWELL Assay检测人肺癌A549细胞系体外侵袭和转移能力的改变。
　　 结果显示:研究中构建的hMTA1-siRNA慢病毒载体可有效转染人肺癌A549和SK—MES-1细胞,人肺癌A549和SK—MES-1细胞转染效率均大于80％。hMTA1-siRNA慢病毒载体对A549细胞和SK-MES—1细胞中MTA1基因有显著的抑制效应,相对NC组,KD组MTA1基因抑制效率分别达到85％以上和80％以上。hMTA1-siRNA慢病毒载体转染人肺癌A549细胞后,肿瘤细胞恶性增殖被明显抑制,侵袭、迁移能力显著下降。
　　 结果提示:针对MTA1基因的RNA干扰可明显抑制肺癌细胞的恶性增殖及侵袭和迁移,MTA1基因在肺癌细胞的恶性增殖和侵袭、迁移过程中具有重要作用,是肺癌治疗潜在的靶点。