蛋白质复合体及蛋白质相互作用研究新策略——四维正交凝胶电泳系统(4-DES,BS4-DES)

摘要

第一部分：四维正交凝胶电泳系统(4-DES)
　　 目前应用于蛋白质复合体及相互作用蛋白质分离纯化的研究主要采用亲和纯化的方法，如免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，co-IP)及串联亲和纯化(Tandem affinity purification，TAP)等。在本研究中，我们提出了一种新颖的可以用来分离纯化并分析胞质蛋白质复合体及蛋白质相互作用的方法——四维正交凝胶电泳系统(4-DES)。该系统由非变性电泳部分(PartⅠ)：1st-DE(Nondenaturing or native thin layer IEF)，2nd-DE(Native-PAGE)及变性电泳部分(PartⅡ:3rd-DE(Denaturing IEF),4th-DE(SDS-PAGE)两部分组成。通过PartⅠ对红细胞及Raji细胞胞质蛋白的分离并结合SDS-PAGE及质谱分析，确定了六种蛋白质复合体候选者：蛋白酶体20S核心复合体(20S core particle of proteasome，CP)，血红蛋白(α2β2)(Hemoglobin(α2β2)，Hb(α2β2))，血红蛋白(α2δ2)(Hb(α2δ2))，过氧化物氧化酶-2(Peroxiredoxin-2,PRDX2)，碳酸酐酶-1(Carbonic anhydrase-1，CAHI)以及热休克蛋白60(Heat shock protein 60，HSP60)。从中选择四种具有不同MW及pI的复合体：CP，Hb(α2β2)，PRDX2及HSP60进行PartⅡ蛋白质组学分析。结果表明4-DES不仅适用于复杂生物样品中的蛋白质复合体及蛋白质相互作用的研究，而且可用于复杂稀释样品中完整蛋白质复合体分离富集。
　　 第二部分：广谱四维正交凝胶电泳系统(BS4-DES)
　　 “蛋白质复合体组学(Protein complexomics)”是21世纪逐渐兴起的并明确的蛋白质组学(Proteomics)极为重要的研究领域。其研究面临的主要挑战是如何从复杂的生物样本中有效地分离出完整的并具有生物活性的蛋白质复合体或相互作用蛋白质，并完成对其结构性亚基详细的蛋白质组学表征。为了解决这一问题，在本研究中，我们基于先前构建的4．DES重新发展并完善出了一种新的电泳系统：广谱四维正交凝胶电泳系统(Broad-spectrum four-dimensional orthogonal electrophoresis system，BS4-DES)。该系统与4-DES相似包括两个部分：非变性电泳部分(Part Ⅰ：1 st-/2nd-DE)及变性电泳部分(Part Ⅱ：3rd-／4th-DE)。不同的是，我们在该系统中发展并优化出了一种温和的酸性非变性凝胶电泳(Acidic-native-PAGE)技术，该技术结合传统的碱性非变性电泳(Basic-native-PAGE)构成了BS4-DES完整的第二维电泳(2nd-DEacidic-basic)，从而扩大了BS4-DES对于极端碱性蛋白质(等电点p，范围：～8．4-11．0)的适用性，研究表明大约有超过1，000种的蛋白质属于这个区域；此外，我们还详细揭示了这种酸性电泳耦合1st-DE：native-tl-IEF蛋白质高分辨率分离机制。结合文献报道并通过一系列保守性计算，理论上这种BS4-DES分离系统至少可以分离4，000种不同的蛋白质复合体或相互作用蛋白质。值得注意的是，为了实现BS4-DES中Part Ⅰ与Part Ⅱ之间真正的无缝连接，我们首次提出了一种新颖高效的蛋白质胶内萃取技术：氨水-超声蛋白质胶内萃取策略(Ammonium hydroxide．ultrasonic protein extractive strategy)，并揭示了其萃取机制。利用这种技术，我们成功地对正常和多种疾病患者血液中的蛋白质复合体进行了分离，并对其中的触珠蛋白(Haptoglobin，Sp)、α1酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein，α1-AG)以及免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)复合体结构性亚基进行了详细的差异蛋白质组学表征。实验结果表明，这种BS4-DES方法不仅广泛适用于蛋白质复合体组学系统性研究，而且可以作为一种简便、常规的技术用于疾病蛋白质组学研究，对疾病的早期诊断以及生物标志物的筛选具有一定的潜在价值。