小鼠大脑皮层发育相关基因自然反义转录物的筛选与鉴定

摘要

非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)已成为当今生命科学领域研究热点之一，随着ncRNA重要功能不断被发现，越来越引起科学界对这些ncRNA的重视。非编码RNA对基因的表达调控起着至关重要的作用，对生物生长发育、疾病发生等生理过程具有广泛影响。
　　 长非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是指一类长度大于200nt，但并不具备编码蛋白质功能的基因转录产物。长非编码RNA在生物体生长发育的各个阶段发挥着重要的调控功能，如在胚胎发育阶段，它可以引起可遗传的等位基因后期沉默，表观性状维持，对多细胞动物的正常发育和细胞分化至关重要。作为一类新类型的长非编码RNA，天然反义转录物(Naturalantisensetranscripts，NAT)由蛋白编码基因的反义链转录产生，其中少数NAT可以编码蛋白。它是在自然环境中生物体内存在的反义RNA分子，与对应的正义RNA(senseRNA)通过碱基互补配对，发挥其对正义基因的调控作用。
　　 1976年，Barrell等在病毒中发现NAT的存在，之后相继在人类、小鼠、大鼠、鸡、果蝇、线虫和水稻、拟南芥、酵母等各种动植物中得到证实。在不同物种中间NAT广泛存在，如大约15％的人蛋白编码基因存在NAT。目前越来越多的研究发现，在真核生物中，NAT通过参与包括基因组印记、RNA干扰、转录、翻译调节、选择性剪接、X染色体失活和RNA编辑等多种基因表达调控过程，影响了生物体的发育以及疾病的发生。而我们对NAT在神经系统发育过程中发挥的作用还知之甚少，本研究旨在寻找与神经系统发育相关的NAT，通过大规模的筛选与鉴定，寻找小鼠大脑新皮层发育过程中相关的基因的NAT，并对其功能做初步探索。
　　 我们选取了小鼠大脑皮层发育相关的63个基因作为候选基因，这些基因包括了在皮层形成过程中起到重要作用的转录因子，皮层特异层次的标记分子等。它们对神经系统的发育特别是皮层发育都起到了至关重要的作用。通过北京大学NAT预测网站http://natsdb.cbi.pku.edu.cn/，对候选基因进行NAT预测，预测结果显示有31个基因可能存在反义转录物。我们用成年鼠脑，E12.5天胎脑，小鼠胚胎成纤维细胞、NIH小鼠成纤维细胞作为筛选材料，用链特异性RT-PCR的方法鉴定，结果确定了8个基因存在NAT。为了对NAT功能进行深入探索，我们应用cDNA末端快速扩增的方法，对8个NAT3’5’末端进行扩增，得到特异的产物后连接到pGEM-T载体中测序，结果得到Id2-NAT,Mef2c-NAT,Foxgl-NAT3’端的序列信息，Lmo4-NAT,Ldb2-NAT,Foxg1-NAT5’端的序列信息。
　　 NAT所发挥的生物学功能与其时空定位密切相关，为了更好的开展NAT与其基因相互作用关系的研究，进而了解它在神经系统发育中的作用，我们首先用原位杂交的方法观察了Lmo4，Ldb2，Foxg1及其相应的反义转录物在小鼠大脑皮层中的表达情况，根据得到的NAT的序列信息设计反义转录物的原位杂交探针，发现了Foxg1及其NAT的表达模式出现了一定的协同趋势。接着我们检测了不同发育时间点E12.5，E14.5，E16.5，E18.5Foxg1及其NAT在鼠脑中的表达，证明了在不同发育时间点都存在这种协同趋势，以上的研究结果为探讨这些皮层发育中重要基因的NAT的功能奠定了基础。

目录

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

不足与展望

参考文献

综述

附录

个人简历

致谢

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