维甲酸、雷帕霉素对神经胶质瘤细胞中RNA结合蛋白表达的影响

摘要

RNA结合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)在细胞内与RNA结合,使RNA的结构和功能发生改变。它们与mRNA前体、mRNA、非编码RNA相互作用,对RNA的生物合成、选择性剪接、翻译、转运和细胞定位等过程产生影响,在基因的转录后水平和翻译水平起到重要的调控作用。RBP功能涉及到各个生理和病理过程,已经报道部分RBP与肿瘤的发生发展关系密切；实验室前期工作以人类神经胶质瘤细胞为研究对象,发现PTB(Polypyrimidine-Tract Binding protein)、PCBP2(Poly(rc)Binding Protein2)等RBPs在神经胶质瘤中高表达。
　　 为了研究抗肿瘤药对RBP表达的影响,我们选取了全反式维甲酸(All-TransRetinoic Acid,ATRA)和雷帕霉素(rapamycin)两种药物。ATRA作用于靶基因启动子区的维甲酸应答元件(Retinoic Acid Responding Element,RARE)调节基因转录,抑制肿瘤细胞增殖、促进分化；而雷帕霉素作用于mTOR(mammalianTarget Of Rapamycin)通路影响基因表达,抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡,产生抗肿瘤作用。
　　 本研究将全反式维甲酸、雷帕霉素以不同的浓度和时间作用于神经胶质瘤细胞(T98G细胞),首先通过MTT实验、细胞免疫荧光和TUNEL(TdT-mediated dUTPnick end labeling脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记)实验检测到活细胞数量减少、分化或凋亡的细胞数量增多,验证了两种药物对T98G细胞的生物学效应,并为后续的实验摸索到了合适的实验条件和科学的处理方法；进而通过Western Blot检测了四种RBP即UNR(Upstream of N—Ras)、UNRIP(UNR-Interacting Protein)、PCBP2和PTB的表达变化,其中UNR、UNRIP、PCBP2的表达随药物作用时间的延长或药物浓度的增加逐渐下调,提示UNR、UNRIP、PCBP2可能为抗肿瘤药物作用通路的下游靶蛋白。
　　 为了通过拯救实验,进一步验证RBP和药物作用后神经胶质瘤细胞产生生物学效应的关系,因此对UNR、UNRIP、PCBP2的真核表达载体进行鉴定及转染效率测定；另外,为了研究全反式维甲酸、雷帕霉素是否通过翻译水平机制使RBP下调,对UNR,UNRIP的5’端非编码区(Untranslated Region,UTR)内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Sites,IRES)进行克隆并将其连接到双顺反子荧光载体。双顺反子载体上带有海肾(Renilla)、萤火虫(Firefly)两种荧光编码基因,但只有海肾荧光编码基因前有启动子区及5’UTR的编码序列,因此将其表达后仅显示海肾荧光。实验中将RBP的5’UTR IRES连接到两种荧光编码基因之间后,因IRES具有类似tRNA的三叶草结构,可以直接与核糖体结合、起始萤火虫荧光编码基因翻译。双顺反子荧光载体的构建为进一步研究全反式维甲酸和雷帕霉素是否通过IRES对RBP产生调控奠定了基础。
　　 以上实验结果表明,全反式维甲酸、雷帕霉素作用于T98G细胞,可以抑制细胞增殖、促进分化或诱导凋亡；UNR、UNRIP、PCBP2随药物作用时间的延长或药物浓度的增加表达逐渐下调。UNR、UNRIP、PCBP2的真核表达载体和5’UTR IRES双顺反子荧光载体可用于进一步验证RBP和药物作用后神经胶质瘤细胞产生生物学效应的关系及其分子机制。上述工作为深入研究RNA结合蛋白是否可能为抗肿瘤药物的新靶点或参与耐药机制提供了新的实验依据。