新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗肿瘤研究及GL331抑制HepG2细胞生长机制研究

摘要

恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一，药物化疗在肿瘤治疗中一直占有重要的地位，其中口服化疗给药方式灵活，同时可以提高病人的生活质量，是一种经济有效的给药方式，越来越受到临床医生的青睐。DNA拓扑异构酶(Topoisomerase，Topo)是细胞内重要的核酶，也是肿瘤化疗的重要靶酶，主要通过催化作用改变DNA的拓扑结构，在细胞DNA复制、转录和有丝分裂等重要的生命过程中发挥着重要作用。鬼臼毒素(podophyllotoxin)是从小蘖科鬼臼属植物鬼臼的根茎中分离得到的一种木脂素，具有显著的抗肿瘤活性，但因毒性强、副作用大使其应用受到限制，而由鬼臼毒素结构改造所得的衍生物依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷（teniposide，VM-26）已经成为临床上常用的TopoⅡ抑制剂，它们对小细胞肺癌、睾丸癌、急性白血病及恶性淋巴瘤等多种癌症均有良好的疗效。但也存在诸如抗癌谱较窄、水溶性差等缺点，还有日益凸现的耐药问题也限制了它们的应用，所以寻找新型鬼臼毒素衍生物一直是重要的研究课题。XWL-1-48是新型的可口服鬼臼毒素衍生物，具有更好的水溶性，易于口服给药，并具有相对较好的生物利用度，本研究对其的抗肿瘤作用及其相关机理进行了研究，同时本文还进一步探讨了曾进入Ⅱ期临床研究的鬼臼毒素衍生物GL331对HepG2细胞体外生长的抑制作用及其作用机制。
　　 本论文分为两部分，第一部分：新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗肿瘤作用及机制研究；第二部分：鬼臼毒素衍生物GL331对HepG2细胞生长抑制作用及机制研究。
　　 第一部分新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗肿瘤作用及其机制研究
　　 本研究主要探索了新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48体内、外抗肿瘤作用及其相关的作用机理。运用TopoⅡα介导的kDNA解连环实验显示，XWL-1-48对TopoⅡα呈现抑制作用并具有一定的剂量依赖性；MTT法检测结果显示XWL-1-48对多株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的细胞毒作用，IC50在0.34-2.11μM之间，其中对HepG2和MCF-7细胞的生长抑制作用更为显著，并呈现一定的时间依赖性，其细胞毒作用强于同系物VP16和GL331，同时XWL-1-48对亲本细胞KB及其耐药株KBV均显示出良好的生长抑制作用，其作用强于GL331和ADR，初步显示出一定的抗耐药作用；集落形成实验表明XWL-1-48能显著抑制HepG2、MCF-7细胞的克隆原形成能力，以上这些结果提示XWL-1-48在体外能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。体内研究结果显示XWL-1-48能够剂量依赖性地抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长，灌胃给药高剂量（8mg/kg）组抑瘤率(74.05％)与VP16（26mg/kg）作用基本相当(73.95%);HepG2及MCF-7裸鼠移植瘤实验表明：XWL-1-48灌胃给药对HepG2、MCF-7肿瘤的抑制作用呈现一定的剂量依赖性，高剂量组(4mg/kg)移植瘤瘤重抑制率略高于阳性药组(VP16，23mg/kg)，以上结果提示XWL-1-48在体内也显示出良好的抗肿瘤效果，并且其抑瘤作用强于VP16，而且XWL-1-48口服给药之后，小鼠体重虽有下降，但是与VP16相比并无显著差异，提示XWL-1-48抑瘤作用强于VP16的同时，并未显示出更大的毒副作用。研究还显示：XWL-1-48使HepG2、MCF-7细胞S期比例升高，说明细胞发生S期阻滞；DAPI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深，提示细胞发生了凋亡，且凋亡细胞随着XWL-1-48浓度的升高而增加；进一步，PI-Annexin V染色后发现XWL-1-48剂量依赖性地诱导两株细胞发生凋亡，作用强于同浓度的GL331，这一结果与抑制细胞增殖的作用相一致。细胞免疫化学结果显示：XWL-1-48能引起DNA损伤相关信号分子,γ-H2AX和p-ATM(Ser1981)表达增加，提示XWL-1-48能够引起细胞内DNA损伤，Western blot结果显示XWL-1-48能激活DNA损伤相关的ATM-Chk2-Cdc25A及ATM-p53-p21信号通路，降低p-Cdk2(Thr160)和Cyclin A的表达，升高p-Cdk2(Thr14)的表达，从而降低S期相关Cyclin A/Cdk2复合物的活性，引起S期阻滞。运用小RNA干扰技术沉默ATM基因后发现，XWL-1-48引起的HepG2细胞S期阻滞有部分恢复，并且除Cyclin A之外，DNA损伤相关信号分子均呈现出相反的变化，这一结果提示XWL-1-48引起的S期阻滞部分依赖于ATM。进一步，XWL-1-48可显著降低Bcl-2蛋白的表达，升高Bax/Bcl-2比例及FasL（在HepG2细胞）或Fas（在MCF-7细胞）的表达，活化Caspase-3，这一结果表明提示XWL-1-48可能启动内、外源性凋亡通路而诱导细胞凋亡。在HepG2细胞，运用小RNA干扰技术靶向沉默p53基因后，XWL-1-48引起的S期阻滞及凋亡并无明显改变，同时，Western blot结果显示p53/p21通路有所恢复，而其他细胞周期相关信号蛋白及凋亡相关信号分子并未出现明显变化，这些结果提示，在HepG2细胞，XWL-1-48引起的细胞周期阻滞和凋亡作用不依赖于p53。研究还发现XWL-1-48可降低Mdm2的蛋白表达水平，减少其进入细胞核，而对Mdm2的基因表达无显著影响，而运用小RNA沉默p53和ATM基因后，未能恢复Mdm2的表达水平，表明XWL-1-48对Mdm2的影响并不依赖于p53和ATM，进一步，我们研究发现XWL-1-48能降低细胞存活相关分子p-Akt(Ser473)及p-Mdm2(Ser166)的水平，进而增强Mdm2的泛素化水平降低Mdm2蛋白质的半衰期，加快了Mdm2蛋白的降解过程，表明对PI3K-Akt-Mdm2存活通路的抑制作用是药物降低Mdm2水平的原因之一。
　　 综上所述：XWL-1-48是新型的口服有效的鬼臼毒素衍生物，具有良好的体内外抗肿瘤作用，并初步显示出一定的抗耐药作用，体内试验显示，其作用强于VP16，且与VP16相比，未显示出更明显的毒副作用。XWL-1-48通过对TopoⅡα的抑制作用，引起细胞内DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞，并启动细胞内、外源性凋亡通路，同时抑制细胞存活通路PI3K-Akt-Mdm2的激活，最终导致细胞死亡。
　　 第二部分鬼臼毒素衍生物GL331对HepG2细胞生长抑制作用及机制研究
　　 GL331是半合成的来源于鬼臼毒素的拓扑异构酶II抑制剂，并进入II期临床研究。本研究观察GL331对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用及作用机制。研究结果表明GL331可以时间和浓度依赖性地抑制HepG2细胞的增殖，并使得HepG2细胞发生S期阻滞和凋亡。GL331能够升高DNA损伤相关分子γ-H2AX的表达，使得细胞内ATM、p-ATM(Ser1981)、p-Chk2(Thr68)、p53、p21、p-Cdk2(Thr14)的表达增加，降低Cdc25A，p-Cdk2（Thr160）和Cyclin A的表达，说明GL331可引起细胞内DNA损伤，激活DNA损伤信号通路ATM-p53-p21和ATM-Chk2-Cdc25A从而引起细胞周期阻滞。进一步，GL331能显著降低细胞内Bcl-2的表达，升高Bax/Bcl-2比例、升高FasL的表达，进而活化Caspase-3，表明GL331可能启动内外源性凋亡通路引起细胞凋亡。
　　 综上所述：GL331在体外显著抑制HepG2细胞的生长，其机制与激活依赖于ATM的DNA损伤相关信号分子从而引起细胞周期阻滞，最终激活细胞凋亡通路而诱导细胞凋亡有关。