lmo4a基因在斑马鱼内耳发育中的功能研究

摘要

目的：世界范围内约有2.78亿人患有中度以上的听力损失，在中国听力语言残疾患者达2780万人。聋病防治主要包括传导性耳聋和感音神经性耳聋两个方面。半个世纪以来，传导性耳聋已经取得成熟的防治经验，感音神经性耳聋的预防和治疗是聋病基础研究的热点与难点。临床上，很多感音神经性耳聋为内耳发育异常所引起。内耳畸形和耳聋病程复杂，功能为不可逆缺失，治疗方法相对局限。寻找更多的内耳畸形、耳聋致病基因，探索致畸致聋机制，并筛选针对发病机制特异性治疗制剂，已成为耳科学基础与临床研究者的共同责任。LMO4基因编码一种转录调节因子，小鼠耳泡中组织特异性敲除LMO4，可见半规管发育异常、半规管嵴发育不良。因此LMO4得到更多学者的关注。斑马鱼内耳发生机制以及前庭形态、功能保守，胚胎透明、易于操作，是研究内耳发育畸形和耳聋的优势模型。本实验主要研究lmo4基因对斑马鱼内耳发育的影响，并探索影响机制，为内耳畸形、感应神经性耳聋的防治奠定理论基础。
　　 方法：本文主要采用斑马鱼胚胎内注射寡核苷酸Morpholino(MO)和mRNA的方法构建lmo4基因低表达和过表达模型；通过表型观察、原位杂交、免疫组化等方式研究lmo4基因对斑马鱼内耳发育的重要作用；通过筛选与内耳结构发生密切相关的基因表达变化研究lmo4基因影响内耳发育的机制；并针对机制筛选可治疗挽救表型的制剂。
　　 结果：斑马鱼中lmo4的两个同源基因分别是lmo4a和lmo4b，两者均为母源性基因。10hpf,lmo4a主要在中胚叶及神经板中表达；14hpf开始表达于耳基板、耳泡及周围基质；随着耳泡发育，lmo4a表达范围与毛细胞区域部分重叠，并标记与半规管发生紧密相关的3个半规管嵴及半规管突起。lmo4b在耳泡、周围基质、及侧线中持续表达。通过Morpholino低表达lmo4b后未观察到内耳表型，我们后期的研究主要集中于lmo4a在内耳的功能。通过Morpholino低表达lmo4a后发现前基板发育受阻；耳泡大小、毛细胞数目、听平衡神经节内细胞数目呈等比减少；同时伴有特异的半规管发育异常（仅水平半规管突起形成）；与半规管发育紧密相关的bmp4，bmp2b明显上调，同时下调BMP信号可很大程度挽救低表达lmo4a诱导的半规管不发育表型。
　　 结论:低表达lmo4a诱导的耳泡大小、内耳毛细胞和神经节的数量减小可归因于lmo4a对前基板早期发育的影响；而半规管畸形是由于BMP信号上调导致；耳泡内注射DM（AMP-activated protein kinase inhibitor，Dorsomorphin）小分子可下调BMP信号，促进半规管发育，挽救畸形。本实验探讨了lmo4a基因在斑马鱼内耳发育的重要作用和作用机制，耳泡内注射小分子DM可促进半规管发育，挽救半规管畸形。