人骨髓间充质干细胞定向分化过程中转录因子KLF2和KLF15的表达研究

摘要

研究背景及意义：成熟脂肪细胞、肌细胞及成骨细胞可以由共同的间充质干细胞分化而来。这三个方向的分化进程相互联系、相互制约，在体内呈现出动态的平衡关系。研究发现有些转录因子处于不同方向分化调控网络的交叉点，其表达水平或与体内各组织分化平衡状态的维持密切相关。KLF转录因子家族(Kr(u)ppel-like factor family)成员KLF2和KLF15在脂肪组织中均有表达，在成脂分化不同阶段发挥重要作用。此外，KLF2还表达于肌肉、骨髓等部位，KLF15还表达于骨骼肌及骨组织，但它们在骨骼肌发育、骨组织形成中是否发挥重要作用还未见报道。目前关于KLF家族成员与细胞分化的相关数据多来自于具有单向分化潜能的细胞系，不利于将不同方向分化机制联系并统一起来，而利用多向分化潜能的间充质干细胞可以同步建立不同方向的体外分化模型，对KLF2和KLF15在各分化过程中的表达进行分析，为进一步研究KLF2和KLF15在成肌、成骨分化过程中的作用机制以及这三种分化过程的联系提供依据。
　　 目的：研究转录因子KLF2和KLF15在入骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成脂、成肌、成骨分化过程中的表达水平及变化趋势，并通过与成脂相关因子PPAR(γ)、GLUT4、成骨相关因子RUNX2及成肌相关因子MYOD的表达模式进行比较，探讨这些因子之间可能存在的联系。
　　 方法：采用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞，将贴壁细胞传代培养，采用第四代细胞分别向成骨细胞、成肌细胞与脂肪细胞进行诱导，应用茜素红、油红O染色和免疫荧光细胞化学方法对诱导分化的细胞进行鉴定。通过荧光实时定量聚合酶链反应(realtimePCR)检测在诱导分化不同时间点KLF2、KLF15、PPAR(γ)、GLUT4、myoD和RUNX2的mRNA表达水平，通过免疫荧光细胞化学方法检测在诱导分化不同时间点KLF2和KLF15蛋白的定位和丰度。
　　 结果：在特定诱导剂作用下hBMSCs可分化为脂肪细胞、成肌细胞与成骨细胞，经鉴定均为阳性。
　　 荧光实时定量PCR结果显示KLF2在hBMSCs成脂、成肌分化早期表达水平均呈下降趋势，在成骨分化中也有下降趋势，早期不明显；KLF15在成脂分化中期及成肌、成骨分化早期mRNA表达水平均表现为上升趋势。免疫荧光染色支持定量PCR结果。
　　 定向诱导hBMSCs成脂、成肌、成骨过程中分别检测到相关标志基因的上调。
　　 结论：在hBMSCs成脂、成肌、成骨分化过程中，转录因子KLF2和KLF15分别表现出明显的变化，表明KLF2与KLF15的表达与骨髓间充质干细胞成脂、成肌、成骨分化的启动和维持密切相关；两者变化情况呈相反趋势，提示KLF2与KLF15可能存在相互竞争。KLF15在成骨分化过程出现显著上调，提示KLF15可能参与成骨分化调控。