大剂量糖皮质激素对骨髓间充质干细胞成骨分化的MiroRNA调控的实验研究

摘要

研究背景
　　 目前，激素性股骨头坏死在非创伤性股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head, ONFH)的发病率中已经居于首位，发病年龄呈年轻化趋势，致残率高，造成了极大的社会经济负担，但其病因还不是十分清楚。基于病理研究，人们发现除微循环障碍导致的毛细血管的微栓塞引起局部骨内压增高，局部缺血坏死外，激素导致的骨髓间充干细胞成骨分化能力的改变，使得骨坏死和修复平衡打破，继而导致股骨头坏死塌陷也是发病机制重要的环节之一。
　　 随着分子生物学和表观遗传学的进展，新近的研究发现microRNA在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中起着非常重要的调控作用，而激素性股骨头坏死的过程中，激素有可能是通过microRNA调控骨髓间充质干细胞的分化潜能而影响骨坏死的发生或修复。因此，我们拟通过对骨髓间充质干细胞采用不同浓度的地塞米松刺激来寻找差异性表达的microRNA，并进一步验证其功能，为激素性股骨头坏死的发生机制和临床应用干细胞治疗提供有力的依据。
　　 研究目的
　　 1．分离、培养及鉴定MSC；
　　 2．建立大剂量糖皮质激素抑制干细胞成骨分化的细胞模型；
　　 3．通过对骨髓间充质干细胞采用不同浓度地塞米松刺激，明确其对细胞生长分化的调控作用；
　　 4．基因芯片筛选不同浓度地塞米松刺激后骨髓间充质干细胞的microRNA表达差异，并进行生物信息学分析，明确其与干细胞成骨分化之间的关系，寻找可能潜在的关键基因;
　　 5．定制microRNA mimics及inhibitors，完成对microRNA功能验证。
　　 研究方法
　　 获取健康成人骨髓，经分离、培养、传代后取得骨髓间充质干细胞第三代，以不同浓度地塞米松成骨诱导液培养，分别于不同的时间点以ALP、茜素红染色，观察细胞增殖及成骨分化能力;脱离成骨诱导体系单纯以不同浓度地塞米松干细胞培养液培养骨髓间充质干细胞48小时，获取RNA后送检基因芯片，筛选差异性表达的基因，并进行生物信息学分析，获取此调控途径中的关键microRNA，定制microRNA mimics及inhibitors，完成对microRNA功能验证。
　　 研究结果
　　 1．采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法可以从骨髓中成功分离出骨髓间充质干细胞，并通过对细胞形态的判别，成骨、成脂能力的检测及相关的细胞表型鉴定得以证实。
　　 2.10-7mol/L地塞米松成骨诱导骨髓间充质干细胞后，随着时间的延长，其细胞增殖及成骨分化均较10-9mol/L组差，且细胞成脂肪分化的趋势明显增强;相关成骨基因的检测结果显示：不同浓度地塞米松培养12天左右，骨钙蛋白、骨桥蛋白、成骨分化特异性转录因子Runx2等表达量在10-9mol/L组比10-7mol/L明显增高，具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3．不同浓度的地塞米松可导致的miRNA表达差异，且在同种异体个体之间具有相对一致的表达趋势，其中miRNA378d/f/g、miRNA1268a/b、miRNA196a/b等在10-7mol/L明显上调，而miRNA422a、miRNA378h/i/c、miRNA29a等则在10-9mol/L组高表达。
　　 4．在具有共同表达趋势的miRNA中，选取感兴趣的miRNA进行生物信息学预测分析发现miRNA378、miRNA23、miRNA29的靶基因分别是成骨信号调节通路上的BMP2、Runx2、DUSP2。
　　 结论
　　 1．人骨髓间充质干细胞在体外能够被分离纯化，并具有独特的细胞学形态、细胞表面标志物及自我更新和多向分化的能力;
　　 2.10-7mol/L地塞米松对于骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化具有明显的抑制作用;
　　 3．不同浓度的地塞米松可以导致骨髓间充质干细胞miRNA表达谱的改变，且异常改变的miRNA与成骨分化的调节具有相关性。