Argonaute2蛋白和DNA双链断裂诱导产生的小RNA调控同源重组的机制研究

摘要

DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)是一种十分有害的DNA损伤形式，假如得不到有效的修复，它能导致基因突变、基因组不稳定甚至造成细胞死亡。因此真核生物进化出了一套复杂的机制来确保DSB得到正确的修复。DSB能够触发细胞内一系列复杂的过程称之为DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)。它需要细胞内DSB信号级联通路中一系列作为探测者(sensor)、传递者(transducer)和效应者(effector)的蛋白之间的精细调控和协同作用来检测和修复细胞内的DSB损伤。小RNA(small RNA，sRNA)是一类约19-30个核苷酸长度的非编码RNA。它们通过在转录水平和转录后水平调控靶基因的表达，以此在许多生物学过程中起着重要作用。sRNA作用的一个共同特点是它们需要结合特定的Argonaute(Ago)蛋白来形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC)以行使它们的特定功能。
　　 最近我们以及其他实验室发现了一类全新的产生于DSB位点附近序列的小RNA分子:DSB诱导的小RNA(DSB-induced small RNA, diRNA)。diRNA在植物、哺乳动物以及果蝇中都是保守的，并且它对于DSB的有效修复起着重要作用。但是，diRNA参与DSB修复的具体机制还不清楚。本研究采用人的细胞系，综合运用各种生物化学和分子生物学技术手段，对其作用机制进行了深入研究。我们研究发现，diRNA参与DSB修复只局限于通过同源重组(homologous recombination, HR)方式而不通过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)方式。diRNA参与DSB修复特异性地依赖于哺乳动物中的效应蛋白Ago2以及RNaseⅢ家族蛋白Dicer。进一步的研究表明diRNA能与HR通路中的一个关键重组酶Rad51组成复合物。Ago2与Rad51之间的相互作用在电离辐射（ionizing radiation，IR）处理后的细胞中有所增强，并且这个相互作用依赖于细胞中ATM和ATR的活性。Ago2结合Rad51是Ago2募集Rad51到DSB位点所必需的，同时Ago2并不影响Rad51上游蛋白在DSB位点的聚集以及ssDNA的形成。虽然Ago2与Rad51的相互作用并不需要diRNA，但是结合diRNA是Ago2募集Rad51到DSB位点从而帮助细胞以HR方式修复DSB损伤所必需的。我们的结果表明，Ago2通过结合产生于DSB位点周围序列的diRNA，募集Rad51到DSB位点去促进细胞内的HR修复。我们的研究结果揭示了diRNA参与DSB修复的作用机理。这些结果不仅进一步拓展了sRNA的功能，而且还首次在DSB修复通路中加入了RNA分子。我们的研究极大地拓展了人们对RNAi领域和DNA损伤修复领域的认识，为人们在研究sRNA的新功能和DSB的修复机制方面提供了新的思路。

目录

摘要

第一章 研究背景及意义

1．1 研究背景

1．1．1 sRNA的种类、特点和功能

1．1．2 sRNA通路的重要蛋白

1．1．3 DSB的产生和特点

1．1．4 DSB的修复

1．1．5 sRNA与DNA损伤修复的关系

1．2 本研究的意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞的转染

2．2．3 质粒的构建

2．2．4 半定量RT-PCR检测基因表达水平

2．2．5 Western blot检测蛋白表达水平

2．2．6 HR和NHEJ实验

2．2．7 细胞周期分析

2．2．8 免疫共沉淀实验分析蛋白-蛋白相互作用

2．2．9 免疫荧光染色和显微镜观察

2．2．10 ssDNA分析实验

2．2．11 RNA回补实验

第三章 实验结果与讨论

3．1 实验结果

3．1．1 Ago2和diRNA特异性参与HR修复

3．1．2 Ago2能与Rad51相互作用

3．1．3 Ago2募集Rad51到DSB位点

3．1．4 Rad51介导HR修复依赖于Ago2／diRNA复合物

3．2 讨论

参考文献

附录

攻读博士期间发表的论文

致谢

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