瘦素在人腰椎间盘髓核退变中的作用及机制研究

摘要

研究背景与目的:
　　 下腰疼(Low back pain，LBP)是最常见的肌肉骨骼系统疾病，年平均发病率可高达30％，据报道大于70％的人在一生中会有下腰痛的症状。椎间盘退行性变(Intervertebral disc degeneration，IDD)是导致下腰痛以及急性椎间盘源性放射痛的最常见病因。随着社会人口老龄化进程加速，IDD患者的数量不断增加。IDD的病因及发病机制目前尚不清楚，可能的相关因素包括物理负重、损伤、震动、感染以、吸烟以及某些遗传影响等。IDD的病因复杂，其确切发病原因目前仍不清楚，目前的研究进展表明:肥胖可显著地致腰痛增加，体重指数BMI≥25kg/m2的与BMI≤25kg/m2相比较，IDD发生率要高4.3倍，因此肥胖是IDD的独立发病因素之一。瘦素(leptin)是一种分子量为16kDa的小分子蛋白，主要由白色脂肪组织分泌，能调整食欲并促进脂肪代谢，引起体重下降。文献报道，循环中瘦素的浓度与肥胖成正比，即肥胖症体内瘦素水平表达增高。近年来的研究发现，瘦素不仅参与脂肪代谢，还参与诸如免疫调节、造血、卵巢功能、肿瘤发生、转移、细胞增殖及炎症反应等多种生理病理过程，并在其中发挥着重要的负作用。已有报道，在骨关节炎患者的关节液、骨赘以及关节软骨中检测到瘦素的表达。还有研究已经证实体外培养的人椎间盘细胞能够自然分泌达到检测水平含量的Leptin蛋白。研究还报道在突出的腰椎间盘髓核细胞中检测到Leptin以及其特异性受体，并进一步证实leptin能在体外刺激椎间盘细胞增殖。这些研究成果为研究肥胖及瘦素引起腰椎间盘退行性病变的机制提供了理论依据，但瘦素是如何引起腰椎间盘退变的作用方式及其具体机制，还不明确，迄今未见有论文发表。本研究的目的为阐述瘦素在椎间盘退变中的作用及其机制。
　　 研究方法:
　　 我们收集腰椎间盘髓核组织，在体外分离培养人髓核细胞并利用Real-timeRT-PCR和免疫荧光染色对髓核细胞进行鉴定。以不同浓度的瘦素作用于体外培养的人髓核细胞，CCK8检测髓核细胞的增殖能力。观察在10ng/ml瘦素刺激下，髓核细胞随着时间增殖能力的变化。应用Western blot法检测髓核细胞中的p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3的表达水平，以Real-time RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色观察髓核细胞cyclin D1、PCNA和Ki-67的表达。应用JAK、PI3K和MEK信号通路抑制剂AG490，Wortmannin和U0126来观察髓核细胞的增殖能力、cyclinD1、PCNA和Ki-67的表达是否被抑制。从人的髓核组织中分离提取RNA和蛋白，Real-time RT-PCR和Western blot检测髓核组织中OBRa和OBRb的表达水平，并结合临床资料进行相关性分析。瘦素作用于体外髓核细胞后，以Real-time RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色观察髓核细胞的骨架蛋白F-actin、β-actin、β-tubulin和vimentin的表达变化情况。以编码YFP-RhoA-PKN-CFP融合蛋白的pRaichu-1237x质粒电转染人髓核细胞。观察在10ng/ml瘦素刺激下，RhoA蛋白的FRET信号改变。应用Western blot法检测p-LIMK1和p-Cofilin的表达变化情况，并应用免疫荧光染色观察瘦素刺激后髓核细胞内F-actin的变化情况。以RhoA和ROCK信号通路抑制剂C3 exoenzyme和Y-27632观察瘦素引起的p-LIMK1、p-Cofilin和F-actin的表达变化是否被抑制。以Real-time RT-PCR和Western blot法观察瘦素刺激髓核细胞后细胞外基质CollagenⅠ、CollagenⅡ、MMP-2和MMP-14的表达水平，并以Western blot法检测p-JAK、p-p38、p-MEK的表达水平。
　　 研究结果:
　　 我们在体外成功分离培养并鉴定了人髓核细胞，并证实CA21、cytokeratin19在髓核细胞中呈高表达，而IBSP、FBN1呈低表达。瘦素通过激活p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3信号通路促进髓核细胞增殖并诱导cyclin D1、PCNA和Ki-67的表达，这些效应能被JAK、PI3K和MEK信号通路抑制剂AG490，Wortmannin和U0126所抑制。OBRa和OBRb的mRNA和蛋白在髓核组织中均有表达，且个体表达差异较大。OBRb和OBRa的表达量与年龄、疾病的类型、腰痛的时间、性别无相关性，但OBRb的表达量与体重指数呈正相关性。髓核细胞在瘦素刺激后，胞浆中F-actin微丝明显粗长，整个细胞的F-actin表达量及荧光强度明显增加，β-actin的表达量增加。Vitmentin的结构无明显变化，其表达量明显上升，而β-tubulin的表达无明显变化。在10ng/ml的瘦素作用下，髓核细胞逐渐回缩伪足，FRET信号逐渐增强，并于刺激后5min时达到峰值。瘦素能刺激髓核细胞的p-LIMk1和p-confilin-2磷酸化并使其骨架蛋白F-actin重塑，这些效应能被RhoA和ROCK信号通路抑制剂C3 exoenzyme和Y-27632所抑制。瘦素能激活髓核细胞p-JAK、p-p38、p-MEK的表达，并上调CollagenⅠ、MMP-2和MMP-14的表达并抑制CollagenⅡ的表达。
　　 结论:
　　 本研究对瘦素在人椎间盘退变中的作用及分子机制进行了研究。我们的研究表明，瘦素受体OBRa和OBRb在椎间盘髓核组织中均有表达，且OBRb的表达量与体重指数呈一定的正相关性。瘦素通过激活JAK、PI3K和MEK信号通路促进髓核细胞增殖。瘦素刺激髓核细胞引起骨架蛋白F-actin、β-actin、β-tubulin和vimentin的表达发生变化。瘦素通过激活RhoA/ROCK和LIMK1/Cofilin信号通路导致骨架蛋白F-actin重塑。瘦素能激活CollagenⅠ、MMP-2和MMP-14的表达而抑制CollagenⅡ的表达。

目录

摘要

缩略词表

前言

常规材料与方法

第一部分 人椎间盘髓核细胞的体外培养

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

五、实验结论

第二部分 瘦素促进髓核细胞增殖及其信号通路的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

五、实验结论

第三部分 瘦素受体的检测及瘦素对人椎间盘髓核细胞骨架蛋白的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

五、实验结论

第四部分 参与瘦素调控骨架蛋白重塑的信号通路研究

一、实验背景及基本原理

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、实验讨论

六、实验结论

第五部分 瘦素对人椎间盘髓核细胞细胞外基质的作用及机制研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

五、实验结论

参考文献

综述

攻读博士期间发表和待发表的文章

致谢

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