单核苷酸多态性和miRNA对CARM1基因表达的调控机制及其在冠心病中的作用研究

摘要

第一部分单核苷酸多态性和miRNA对CARM1基因表达的调控机制及其在冠心病中的作用研究
　　 目的:
　　 阐明调控辅激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associated argininemethyl-transferase1，CARM1)基因表达的分子机制，探索其通过何种作用方式参与冠心病的发生，试图揭示该基因在冠心病发生中的作用及机制，为冠心病的预防和治疗提供新的靶点。
　　 方法:
　　 1)利用real-time PCR和Western blot方法分别在mRNA和蛋白水平上检测冠心病病例和对照的外周血单个核细胞(PBMCs)中CARM1的表达水平;2）综合利用HapMap数据库中连锁不平衡(LD)分析和“DNA元件百科全书”(ENCODE)的功能注释数据，筛选CARM1基因上下游10kb内位于不同LD区域中的潜在功能性单核苷酸多态性（SNP）;在234例健康个体的PBMCs样本中检测CARM1 mRNA的表达水平，分析其与SNP基因型的关系;对影响CARM1表达的SNP进行生物学功能研究:应用双荧光素酶报告基因系统检测等位基因特异性的转录激活活性，利用电泳迁移率变更实验(EMSA)、多种转录因子冷竞争实验(MC-EMSA)、电泳超迁移率变更分析(supershift-EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)分别在体外和细胞内筛选、鉴定等位基因特异性结合的转录因子;3）通过生物信息学预测调控CARM1的靶miRNA;利用real-time PCR检测其在冠心病病例和对照中的表达;通过共转染野生型或种子区突变的CARM13'-UTR区报告基因及靶miRNA模拟物(mimics)证明该miRNA结合CARM13'-UTR种子区;在细胞水平上过表达或敲减该miRNA，通过real-time PCR和Western blot检测CARM1的mRNA和蛋白水平，明确其对CARM1表达的调控;4）通过CARM1的功能性多态位点与血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平的关联研究，及细胞中过表达人源CARM1后ELISA检测细胞上清及胞内Hey的水平，探索CARM1对Hey盼调控作用;5）在1010例冠心病病例和3998例对照中进行CARM1的功能性位点与冠心病的关联研究，使用加性模型分析少见等位基因对冠心病发生的效应。
　　 结果:
　　 1)与对照组相比，急性冠脉综合征(ACS)组PBMCs中CARM1的mRNA水平升高3.9倍，蛋白水平升高1.5倍;2）根据LD分析和ENCODE证据，筛选出4个潜在功能性SNP;在健康人群中3个SNP位点与CARM1的表达水平相关，即rs12460421(A/G)、rs117569851(T/C)和rs4804544(A/G)，其中后两个位点完全连锁;报告基因实验结果表明，rs12460421-rs117569851单体型GC和单体型AT的转录活性分别是单体型GT的2.0倍和1.7倍;EMSA结果显示rs12460421的A等位基因与核蛋白的结合能力强于G，rs117569851的C等位基因与核蛋白的结合能力强于T;MC-EMSA筛选出转录因子Egr-1与这两个位点结合;supershift-EMSA和ChIP实验分别在体外和细胞内水平证明Egr-1结合这两个位点且不同等位基因与Egr-1的亲和力不同;3）生物信息学预测与CARM1结合的靶miRNA为miR-15a和miR-16;与对照组相比，ACS病例组的PBMCs中miR-15a的表达水平降低37％，而miR-16则表达升高;野生型和突变型CARM13'-UTR的报告基因与miR-15amimic共转染细胞后，双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-15a与CARM13'-UTR的两个种子区都发生结合;在293T细胞中过表达miR-15a不引起CARM1下调，但敲减miR-15a后CARM1表达增加;4）在健康人群中，CARM1的功能性多态位点rs117569851与血浆Hcy水平存在关联(P=0.02)，每增加一个少见等位基因T，Hcy的水平降低2.16μmol/L;5）rs117569851与冠心病的关联研究未检出统计学差异（校正年龄、性别、BMI后P=0.053）。
　　 结论:
　　 1) ACS患者PBMCs中CARM1基因的mRNA和蛋白水平表达水平升高，提示该基因在冠心病的发生中可能起重要作用;
　　 2) CARM1启动子区功能性多态位点rs117569851的少见等位基因T通过降低与转录因子Egr-1的结合，下调CARM1的表达，降低血浆Hey水平，从而可能潜在减少冠心病的发病风险;
　　 3) miR-15a在ACS患者PBMCs中表达下降，减轻了对CARM1 mRNA的降解和蛋白翻译的抑制作用，从而使CARM1的表达水平升高;
　　 4)关联研究表明CARM1的功能性多态rs117569851-通过调控Hcy代谢，可能参与冠心病的发生。
　　 第二部分 LPL基因多态位点rs1059611影响转录活性的初步研究
　　 目的:
　　 GWAS表明位于脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)3'-UTR的多态位点rs1059611与血脂水平关联，但其是否具有生物学功能尚不清楚。本研究初步探索该位点对转录活性及转录因子亲和力的影响。
　　 方法:
　　 1)在pGL-3 promoter载体的报告基因下游插入含有rs1059611(C/T)位点的基因组序列，构建重组质粒;利用双荧光素酶报告基因系统，检测该位点对转录活性的影响;
　　 2)提取人内脏脂肪组织核蛋白，与含有rs1059611(C/T)位点的探针孵育后进行电泳迁移率变更实验(EMSA)，比较两个等位基因与核蛋白结合形成的迁移带的差异;分别用C等位基因和T等位基因的冷竞争探针与核蛋白预孵育，再加入生物素标记的探针进行冷竞争EMSA实验，观察迁移带是否消失。
　　 结果:
　　 1)含有rs1059611位点的序列能够增强转录活性，常见等位基因T转换为少见等位基因C后转录活性显著增高(0.69 vs1.00);2) rs1059611的T等位基因探针与脂肪组织核蛋白结合形成的迁移带在灰度上高于C等位基因;个体A的脂肪组织核蛋白与等位基因结合的差异比个体B更显著;200倍冷竞争探针预孵育使迁移带完全消失。
　　 结论:
　　 rs1059611的常见等位基因T转换为少见等位基因C后转录活性增高;rS1059611的常见等位基因T结合转录因子的亲和力大于少见等位基因C。说明rs1059611具有影响转录活性的生物学功能。

目录

第一部分 单核苷酸多态性和miRNA对CARM1基因表达的调控机制及其在冠心病中的作用研究

摘要

前言

一、材料与方法

1．主要试剂与仪器设备

2．研究对象

3．实验方法

4．统计方法

二、实验结果

1．CARM1在急性冠脉综合征患者的外周血单个核细胞中表达水平升高

2．功能性SNP对CARM1转录水平的调控作用

3．miR-15a对CARM1的转录后调控

4．CARM1影响同型半胱氨酸水平

5．CARM1基因与中国人冠心病的关联研究

三、讨论

1．CARM1与冠心病的关系

2．CARM1对同型半胱氨酸的调控

3．SNP调控CARM1表达水平的分子机制

4．miR-15a对CARM1表达的转录后调控

5．研究特色和创新性

6．局限之处

7．下一步研究计划

四、结论

参考文献

综述

第二部分 LPL基因多态位点rs1059611影响转录活性的初步研究

摘要

前言

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附录

缩略词

致谢

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