基于DNM-1的抗耐药菌药物评价模型的建立及实验诱导肠杆菌科细菌的药敏分析与机制研究

摘要

近十年来，G-杆菌耐药问题日益严重，突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae，CRE，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等)、非发酵糖细菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等），其中肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药最为严重，临床治疗困难。
　　 碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌等G-杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制，自1983年在肠杆菌科细菌中首次报道超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)以来，肠杆菌科细菌的耐药问题日趋严重。2001年美国第一次发现肺炎克雷伯碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC酶)，并很快在美国乃至全球传播，遍及北美、南美、亚洲、欧洲等几十个国家和地区。我国2007年首次报道产KPC酶肺炎克雷伯菌，造成大范围流行，并传播至大肠埃希菌、克雷伯菌等其它肠杆菌科细菌。2009年，英国人首先报道了在印度新德里发现的第一例产金属β-内酰胺酶NDM-1的超级耐药肺炎克雷伯菌株感染病例，其后，美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚和我国香港等地区相继有感染病例报道，引起全球高度关注。这种产NDM-1的超级细菌对几乎所有的临床常用抗菌药物包括治疗G-杆菌“王牌药”碳青霉烯类抗生素都呈现耐药性，仅有粘菌素、替加环素等极少数抗生素相对有效，但已出现对粘菌素、替加坏素耐药的超级耐药菌。因此，研发新型抗耐药菌药物已迫在眉睫。基于此背景，我们主要进行了以下两部分研究:
　　 第一部分基于NDM-1的抗耐药菌药物评价模型的建立
　　 主要目的是为研发新型抗产NDM-1细菌药物奠定基础。首先，通过分子克隆技术成功构建了NDM-1蛋白外源表达体系，并纯化得到重组NDM-1酶。测得NDM-1对美罗培南水解反应的酶动力学参数(Km=63.3±7.5μM，Kcat=42.6±1.8s-1，Kcat/Km=0.67 s-1/μM)，并验证了EDTA为NDM-1的抑制剂，而他唑巴坦及克拉维酸不是。基于此，建立了酶水平的NDM-1抑制剂评价模型，并进行了7种化合物活性评价，结果显示此7种化合物均不能有效抑制NDM-1的活性。此外，构建的全长基因NDM-1转化子表现出产NDM-1酶菌株应有的对β-内酰胺类药物（包括碳青霉烯类）耐药的特性，因此能够用于在菌体水平进行药物评价。
　　 第二部分实验诱导肠杆菌科细菌的药敏分析与机制研究
　　 该实验总的目的是为碳青霉烯类抗生素、粘菌素及替加环素的临床合理应用提供参考，以期减少或减缓碳青霉烯类耐药问题，并对临床治疗产NDM-1细菌感染可能引发的耐药问题提供前瞻性研究。主要进行了以下两方面工作:
　　 1.体外诱导大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物敏感性降低及机制研究
　　 目的是拟在实验室条件下评价碳青霉烯类抗生素能否体外诱导肠杆菌科细菌对其敏感性降低甚至耐药，并分析机制。首先，大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌经碳青霉烯体外诱导后分离得到11个突变株。药敏试验显示突变株对诱导用碳青霉烯敏感性显著降低，且对其他β-内酰胺类药物（包括其他碳青霉烯类抗生素）敏感性也呈现不同程度的降低;PFGE显示突变株与亲本株同源。通过PCR、DNA测序、外膜蛋白SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF及Real-time PCR等研究发现菌株对碳青霉烯类抗生素敏感性降低受外排泵、β-内酰胺酶影响不大，而与基因插入失活等机制引起的外膜蛋白（OmpK36、OmpC、NmpC、LamB、OmpF）缺失或表达降低有关。
　　 2.体外诱导产NDM-1肺炎克雷伯菌对粘菌素及替加环素敏感性降低及机制研究
　　 目的是拟在实验室条件下评价粘菌素及替加环素能否体外诱导产NDM-1肺炎克雷伯菌对其敏感性降低甚至耐药，并分析机制。首先，产NDM-1肺炎克雷伯菌经粘菌素或/及替加环素体外诱导后分离得到突变株;药敏试验显示突变株对粘菌素及替加环素敏感性显著降低，并产生（高水平）耐药。无药传代表明突变株对粘菌素敏感性降低呈现不可逆性，而对替加环素敏感性降低是可逆的。PFGE证实突变株与亲本株同源。小鼠腹腔感染试验显示双药诱导得到的“全耐药”菌株致病力有所降低，但仍能致死。为探讨耐药产生机制，进行了外膜蛋白SDS-PAGE及菌体总蛋白2-DE试验。结果表明，细菌对两种药物的敏感性降低与外膜蛋白无关，但其机制仍有待研究。
　　 总之，本研究建立了基于NDM-1的抗耐药菌药物评价模型，为药物研发奠定了基础。此外，本研究发现，肠杆菌科细菌经碳青霉烯类抗生素、粘菌素及替加环素体外诱导后对这些药物的敏感性降低，提示在临床治疗中应注意此现象。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一部分 基于NDM-1的抗耐药菌药物评价模型的建立

第1章 前言

第2章 基于NDM-1的抗耐药菌药物评价模型的建立

一、实验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、结论

第二部分 实验诱导肠杆菌科细菌的药敏分析与机制研究

第1章 前言

第2章 体外诱导大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物敏感性降低及机制研究

一、实验材料

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第3章 体外诱导产NDM-1肺炎克雷伯菌对粘菌素及替加环素敏感性降低及机制研究

一、实验材料

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、结论

小结

参考文献

个人简历、在校期间发表的学术文章

致谢

附录