豚鼠抗流感病毒相关因子研究及H9N2亚型禽流感病毒致病力分析

摘要

近年来A型流感病毒(AIV)在中国的频繁暴发给人们的生命健康带来了严重威胁，造成了巨大的经济损失。高致病性流感病毒会导致感染动物体内炎性因子大量升高，由此认为细胞因子风暴是导致动物死亡的主要原因。早期研究证明流感病毒可以在豚鼠体内感染复制，本研究进一步发现病毒感染并不能导致豚鼠机体产生“高细胞因子风暴”，且豚鼠可以在感染后5～7天清除流感病毒，这为我们研究宿主利用先天性免疫应答机制清除流感病毒提供了十分理想的动物模型。本课题共分为两大部分，第一部分主要是利用豚鼠作为模式动物，豚鼠细胞系作为模式细胞，利用H5N1禽流感病毒作为模式病毒研究宿主抵抗流感病毒的先天性免疫决定因子。主要利用iTRAQ定量蛋白质组学方法结合转录水平分析对AIV感染的豚鼠肺脏组织和肺成纤维细胞系进行表达谱分析。在此基础上，对差异表达蛋白进行抗AIV功能的探索，筛选到了抑制流感病毒复制和下调细胞因子的关键蛋白，明确了豚鼠抗炎性反应的关键通路。论文第二部分为了探索低致病H9N2禽流感病毒对人类的致病性，利用恒河猴作为动物模型进行了H9N2流感病毒致病力分析。具体介绍如下:
　　 第一部分:
　　 通过对豚鼠肺脏组织和肺脏成纤维细胞转录水平和蛋白表达谱变化分析，结果表明无论从体内水平（豚鼠肺脏）还是体外水平（豚鼠肺成纤维细胞），豚鼠感染H5N1AIV后都没有高细胞因子的发生。感染豚鼠24小时后引发肺脏65个蛋白表达上调，135个蛋白表达下调。感染72小时后引发肺脏24个蛋白表达上调，39个蛋白表达下调。AIV感染肺脏成纤维细胞12小时后引发61个蛋白表达上调，71个蛋白表达下调。感染24小时后引发51个蛋白表达上调，30个蛋白表达下调。AIV感染后导致豚鼠肺脏和肺成纤维细胞中免疫应答相关基因表达发生变化，这些基因参与IFN途径、细胞凋亡以及补体激活等。这些H5N1 AIV感染变化基因可能具有抗病毒作用，也可能具有调节细胞因子的作用。
　　 利用过表达技术和RNAi技术，在体外过表达RIG-Ⅰ、MVAS、SPA、SPD、GBP-1、Mx-1、HSP70和HSP90，同时对GBP-1进行RNAi体外抑制该基因表达，探索上述基因的抗AIV活性。结果表明过表达RIG-Ⅰ和MAVS可明显抑制流感病毒在豚鼠细胞中的复制，Mx-1也具有抑制作用，但效果不如RIG-Ⅰ和MAVS明显。GBP-1细胞水平过表达可以下调流感病毒诱导的细胞因子，其在协同RIG-Ⅰ发挥抗AIV作用中发挥重要作用。
　　 通过研究AIV感染后豚鼠体内补体变化情况发现，豚鼠感染AIV后会导致体内补体C3表达量升高。通过药物拮抗豚鼠体内补体后其抗流感病毒能力明显减弱，同时伴随着抑制体内细胞凋亡，显著上调趋化因子IP10的表达量，表明补体可能通过调控体内细胞凋亡进而可以发挥调节细胞因子的作用。
　　 第二部分:
　　 利用非人类灵长类动物——恒河猴作为模式动物进行了H9N2 AIV致病性研究，结果表明感染后恒河猴出现双向热和病毒性肺炎，可以从感染猴的鼻洗液和咽拭子中分离出流感病毒，排毒期持续7～9天，组织嗜性和免疫组化结果表明H9N2 AIV可以在上呼吸道（鼻甲骨、气管和支气管）和所有的肺叶中复制。通过本次研究表明恒河猴是一种研究H9N2 AIV进化和致病力的较为理想的动物模型。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 流感病毒病原学基础

1．1 流感病毒概述

1．2 流感病毒的复制

1．3 禽流感病毒的毒力和致病力

1．4 流感病毒的宿主屏障和在哺乳动物间水平传播机制

1．5 禽流感病毒流行现状

1．6 流感病毒研究中的常用动物模型

2 流感病毒引起的宿主先天性免疫应答研究

2．1 固有免疫应答识别机制

2．2 细胞因子和趋化因子

2．3 凋亡和炎性反应

第二章 流感病毒感染豚鼠肺脏组织及肺成纤维细胞蛋白质表达谱变化

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 实验动物与细胞

1．3 仪器

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 实验结果

2．1 H5N1禽流感病毒感染豚鼠病毒滴定

2．2 H5N1禽流感病毒在肺脏成纤维细胞上的生长特性

2．3 H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内外相关因子表达情况

2．4 H5N1禽流感病毒感染豚鼠肺脏蛋白表达谱变化

2．5 H5N1部分差异表达蛋白的转录水平分析

2．6 部分差异表达蛋白的Western blot验证

2．7 差异蛋白的聚类分析

2．8 差异蛋白的pathway分析

3 讨论

4 小结

第三章 影响流感病毒致病性的宿主相关因子

1 材料与方法

1．1 病毒与载体

1．2 实验动物与细胞

1．3 仪器

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 实验结果

2．1 H5N1流感病毒感染豚鼠传代细胞系

2．2 过表达载体的验证和GBP-1 shRNA的筛选

2．3 蛋白过表达抗AIV效果分析

2．4 过表达后细胞感染AIV相关因子变化

2．5 抑制GBP-1基因表达减弱RIG-Ⅰ促进的抗病毒作用

3 讨论

4 小结

第四章 补体的抗流感病毒作用

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 实验动物与细胞

1．3 仪器

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 实验结果

2．1 CVF处理后豚鼠体内补体拮抗效果

2．2 流感病毒感染豚鼠后体内补体含量升高

2．3 Western blot验证BAL中补体含量

2．4 组织病理学观察豚鼠肺脏病理变化

2．5 补体拮抗后豚鼠抗病毒能力明显减弱

2．6 补体影响豚鼠肺脏细胞凋亡

2．7 补体拮抗引起细胞因子上调

3 讨论

4 小结

第五章 H9N2亚型禽流感病毒致病力分析

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 实验动物

1．3 仪器

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 实验结果

2．1 临床症状观察

2．2 感染后病毒分离结果

2．3 H9N2流感病毒感染后组织嗜性

2．4 组织病毒学观察

2．5 血清学结果

3 讨论

4 小结

结论

缩略词

参考文献

致谢

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