BST-2抑制IAV感染机制研究及以结构预测为基础的APOBEC3G与Vif作用机制研究

摘要

由于病毒的高变异性，极易对抗病毒药物产生耐受。如以宿主限制因子为靶点进行新药筛选，恢复其抗病毒功能，可减小由于药物选择压力导致的病毒耐药性。因此以宿主限制因子与病毒相互作用为靶点筛选新药成为目前研究热点之一。而深入了解宿主限制因子与病毒蛋白间的作用机制成为推动这一研究发展的前提。基于此目的，本文两部分分别研究了宿主限制因子BST-2与甲型流感病毒(IAV)基质蛋白2(M2)、APOBEC3G与HIV-1 Vif蛋白间的作用机制。
　　第一部分研究了BST-2对IAV的影响。BST-2是定位于细胞膜脂筏区域的宿主限制因子，可以抑制多种包膜病毒的释放。IAV也利用细胞膜脂筏区域完成出芽，BST-2可能对流感病毒的释放也有具有抑制作用。基于这一设想，我们分别研究了BST-2对IAV释放的影响。研究发现，BST-2对于流感病毒的释放具有抑制作用。BST-2可以下调IAV M2蛋白的表达，推测BST-2可能通过抑制M2蛋白的生物学功能，影响病毒颗粒的出芽。通过进一步研究发现，BST-2可能是利用非泛素依赖的蛋白酶体途径下调M2蛋白的表达。同时，对BST-2与M2蛋白相互结合与降解所必需的结构域进行了研究。我们还发现牛源BST-2同样可以抑制IAV颗粒释放，与人源BST-2相似的是，牛源BST-2也有可能通过干扰M2蛋白的生物学功能，影响病毒颗粒的释放。
　　第二部分研究了APOBEC3G与Vif作用机制。本实验以同源建模和比较建模的方法，分别构建了APOBEC3G二聚体和APOBEC3G-Vif复合物的蛋白结构模型。发现APOBEC3G的124-127位氨基酸残基既参与了APOBEC3G二聚体的形成，同时也参与到了与Vif的相互作用。实验发现，Vif可以打开细胞内APOBEC3G的二聚体，提示了Vif降解APOBEC3G的底物可能是单体。进一步实验证明，APOBEC3G形成二聚体以及与Vif相互结合均是通过其N末端形完成的。通过对APOBEC3G124-127位氨基酸残基进行突变，发现任一氨基酸残基的改变都会对APOBEC3G在细胞中的分布产生影响，并且氨基酸残基突变也可以影响APOBEC3G二聚体的形成;但这四个单独的氨基酸残基突变均可以被Vif降解，并且不影响其与Vif的结合。针对这四个氨基酸残基进行的多点突变发现，两个以上氨基酸残基的改变会更加显著的影响APOBEC3G二聚体的形成，也会影响Vif对其降解，但是依旧不影响与Vif的结合。结果表明APOBEC3G二聚体的形成以及与Vif的相互作用均涉及到多个氨基酸的共同作用，并且APOBEC3G与Vif结合所需的区域与APOBEC3G被Vif降解所需的区域可能并不相同。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一部分 BST-2抑制甲型流感病毒IAV机制研究

前言

实验材料

1．细胞系

2．试剂

3．试剂盒

4．质粒

5．主要实验仪器

6．其它溶液及耗材

实验方法

1．质粒构建

2．细胞培养及转染

3．蛋白免疫印迹(Western Blot)

4．甲型流感病毒(IAV)的制备

5．流感病毒TCID50的测定

6．IAV病毒的感染

7．利用荧光素酶(Gluc)快速检测IAV相对病毒感染力

8．RNA稳定性测定

9．细胞总RNA提取

10．real-time RT-PCR检测mRNA含量

11．生物发光共振能量转移(BRET)检测蛋白相互作用

12．免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)

实验结果

1．BST-2可以抑制流感病毒的感染性

2．BST-2蛋白可以抑制IAV M2蛋白的表达

3．BST-2蛋白下调流感病毒M2蛋白机理的研究

4．BST-2与M2蛋白在细胞内存在相互作用

5．与M2蛋白相互作用有关的BST-2重要功能区研究

6．与BST-2相互作用有关的M2蛋白功能区的研究

7．其他种属BST-2对流感病毒抑制的抑制

讨论

第二部分 以结构预测为基础的APOBEC3G与Vif作用机制研究

前言

实验材料

1．细胞系

2．试剂

3．试剂盒

4．质粒

5．主要实验仪器

6．其它溶液及耗材

实验方法

1．模型构建

2．质粒构建

3．细胞培养及转染

4．蛋白免疫印迹(Western Blot)

5．荧光强度检测蛋白含量

6．生物发光共振能量转移(BRET)检测蛋白相互作用

7．免疫共沉淀(Co．-immunoprecipitation，Co-IP)

8．荧光显微镜(Flourescence Microscopy)检测胞内蛋白定位

实验结果

1．模型的构建

2．Vif阻止APOBEC3G二聚体的形成不依赖于对APOBEC3G的降解

3．Vif通过间接作用影响了APOBEC3G二聚体的形成

4．APOBEC3G通过N末端形成二聚体并与Vif结合

5．APOBEC3G N末端可以阻碍Vif与全长APOBEC3G的结合

6．APOBEC3G 121-130位氨基酸残基不能与APOBEC3G结合

7．APOBEC3G单氨基酸残基突变对二聚体的影响

8．APOBEC3G多氨基酸残基突变对二聚体形成的影响

9．APOBEC3G单氨基酸残基突变不影响Vif对其降解及与Vif的结合

10．APOBEC3G多氨基酸残基突变可阻止Vif对其降解但不影响与Vif结合

讨论

综述

参考文献

发表文章

致谢