猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗效检替代方法和猪瘟病毒鉴别检测方法的建立

摘要

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接触性、多系统出血性猪传染病。我国对于猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗大规模免疫为主。但是点状散发的猪瘟疫情仍时有发生，并且在我国分布广泛，流行态势日趋复杂。
　　 在这种情况下需要对疫苗免疫和野毒感染动物进行鉴别检测，调查猪场中猪瘟隐性感染或持续性感染的情况，同时通过一定的方法提高猪瘟兔化弱毒疫苗的质量。本研究旨在建立猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗的效检替代方法以及对猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和牛病毒性腹泻病毒的鉴别检测方法，为我国猪瘟的防控工作提供帮助。(1)以兔体定型热法进行猪瘟疫苗效检受试验兔个体差异和饲养环境的影响很大。本研究将待检疫苗系列稀释后接种易感细胞，使用RT-nestPCR、RT-PCR和抗原捕获ELISA三种方法检测细胞感染后产生的子代病毒。不同疫苗所能够检测到的阳性稀释度的高低可以反映疫苗中的有感染性病毒粒子的浓度，以最高阳性稀释度作为疫苗效价的指标。使用该方法对12批猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗和3批猪瘟兔化弱毒牛睾丸疫苗进行效检并与兔体定型热法效检的结果进行比对。结果表明，ST传代细胞源疫苗的阳性稀释度达到10-6～10-7，每头份含2.6×104～3.0×104 RID。牛睾丸疫苗的阳性稀释度≤10-4，每头份含7.0×103～8.0×103 RID，本方法效检的结果与兔体定型热法存在一定的相关性，并且能够反映疫苗中有感染性病毒粒子的多少。(2)在猪瘟兔化弱毒基因组3'端12nt多聚T碱基插入区域两侧的保守区域内分别设计一对外围引物和一对内围引物。猪瘟兔化弱毒的扩增片段因包含有多聚T碱基插入片段所以要长于猪瘟野毒的扩增片段。RT-nestPCR方法对于猪瘟兔化弱毒C株和猪瘟石门毒的检测极限分别为0.032pg和0.045pg病毒RNA。特异性试验的检测结果显示，该方法能够有效检测各类型的猪瘟病毒，对非猪瘟的其它病原的检测结果均为阴性。对400份健康猪扁桃体临床样本进行检测得到4份猪瘟兔化弱毒和12份猪瘟野毒阳性样本。对14批猪瘟兔化弱毒疫苗的检测表明所有疫苗均可检测到猪瘟兔化弱毒并且未发现存在猪瘟野毒污染。所建立的RT-nestPCR鉴别检测方法能够有效区分猪瘟兔化弱毒和猪瘟野毒，特异性好、灵敏度高。(3)通过对47条猪瘟病毒、7条牛病毒性腹泻病毒和3条边界病毒基因组全序列比对，分别在猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和BVDV基因组保守区域设计了3条TaqMan-MGB探针和配套引物。采用正交试验设计对上、下游引物浓度、探针浓度以及退火温度进行优化。特异性试验表明该方法在同时鉴别检测猪瘟兔化弱毒、不同基因型的猪瘟野毒和BVDV时均能在相应荧光通道观察到特异性扩增曲线，各通道间无荧光干扰，对其它病毒的检测则无扩增曲线。重复性试验结果显示组间和组内变异系数均不大于1％。敏感性试验表明该方法对猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒Shimen株、BVDV_Oregon株的检测极限分别为31.4拷贝/μL、15.8拷贝/μL、32.5拷贝/μL。对400份临床组织样本检测得到4份猪瘟兔化弱毒阳性、12份猪瘟野毒阳性、22份BVDV阳性，对14批商品化猪瘟兔化弱毒疫苗的检测表明均能检测到猪瘟兔化弱毒，并且无猪瘟野毒和BVDV污染，与其它检测方法的符合率达到95％以上。本方法可以同时定量检测和区分猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和BVDV，可以用于区分野毒感染和疫苗免疫动物，同时还可以对猪瘟疫苗的质量进行监控。(4)为了对我国种猪场内猪瘟病毒的隐性感染情况进行了调查。对采集自中国北方部分地区种猪场临床健康猪的400份扁桃体进行检测并对猪瘟野毒阳性样本进行病毒分离，成功得到11株猪瘟病毒分离株。基于E2全基因序列的遗传进化分析表明这11株猪瘟病毒全部属于2.1a亚型。推导氨基酸序列的分析表明，这11株病毒在E2蛋白抗原结构域中的部分位点发生了一致的、与其它猪瘟病毒分离株都不同的变异。
　　 本研究通过所建立的RT-nestPCR和三重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法对我国北方地区种猪场内猪瘟病毒隐性感染进行了调查，并对所分离病毒E2基因序列的分析特征进行了分析。对我国猪瘟的防控具有一定的参考意义。同时建立了应用于猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗的效检替代方法，可以取代基于动物试验的疫苗效检方法，为生产高质量的猪瘟疫苗提供了帮助。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 猪瘟和猪瘟病毒概述

1．1．1 猪瘟概述

1．1．2 猪瘟病毒粒子的结构和理化性质

1．1．3 猪瘟病毒的基因组结构

1．1．4 猪瘟病毒对细胞结构的侵入

1．1．5 猪瘟病毒的编码蛋白及其功能

1．1．6 猪瘟病毒的遗传分型

1．1．7 猪瘟兔化弱毒疫苗概述

1．2 猪瘟诊断方法概述

1．2．1 免疫荧光试验

1．2．2 病毒分离

1．2．3 间接血凝试验

1．2．4 病毒中和试验

1．2．5 酶联免疫吸附试验

1．2．6 新城疫病毒强化法

1．2．7 传统PCR检测方法

1．2．8 荧光定量PCR检测方法

第二章 猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗体外效检替代方法的建立和应用

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 猪瘟兔化弱毒疫苗

2．2．2 细胞及试验动物

2．2．3 试剂和仪器

2．2．4 效检替代方法操作流程的建立

2．2．5 效检替代方法对成品疫苗的检测

2．2．6 兔体定型热法测定成品疫苗

2．3 结果

2．3．1 猪瘟兔化弱毒湿毒系列稀释后接种细胞所收样品的检测

2．3．2 效检替代方法对成品疫苗的检测

2．3．3 兔体定型热法的效检结果与比较

2．4 讨论

第三章 鉴别检测猪瘟兔化弱毒和野毒的RT-nestPCR检测方法的建立和应用

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 引物设计

3．2．3 RT-nestPCR检测方法的建立

3．2．4 RT-nestPCR方法检测临床样本和猪瘟兔化弱毒疫苗

3．3 结果

3．3．1 优化后的外围和内围PCR反应体系和反应条件

3．3．2 巢式PCR方法的敏感性和特异性测定

3．3．3 临床样本和猪瘟疫苗的检测

3．4 讨论

第四章 鉴别检测猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和牛病毒性腹泻病毒的三重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 引物和探针设计

4．2．3 病毒RNA的提取、反转录和支原体基因组DNA提取

4．2．4 三重荧光定量RT-PCR标准品的制备

4．2．5 三重荧光定量PGR反应条件的优化

4．2．6 特异性试验

4．2．7 敏感性试验

4．2．8 重复性试验

4．2．9 三重荧光定量RT-PCR检测临床组织样品和商品化猪瘟兔化弱毒疫苗

4．2．10 三重荧光定量RT-PCR与其它检测方法的符合率试验

4．2．11 病毒分离鉴定

4．3 结果

4．3．1 溶解曲线的建立及RT-PCR扩增

4．3．2 三重荧光定量RT-PCR反应条件的优化

4．3．3 三重荧光定量RT-PCR特异性试验

4．3．4 三重荧光定量PCR标准曲线的建立和敏感性试验

4．3．5 三重荧光定量RT-PCR重复性试验

4．3．6 三重荧光定量RT-PCR检测临床样品和商品化猪瘟兔化弱毒疫苗

4．3．7 三重荧光定量RT-PCR与其它检测方法的符合率

4．3．8 病毒分离鉴定结果

4．4 讨论

第五章 分离自中国北方部分地区种猪场临床健康猪的猪瘟病毒E2基因序列的分析

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 临床样品、病毒检测和病毒分离

5．2．2 RT-PCR扩增和序列测定

5．2．3 E2基因序列分析

5．3 结果

5．3．1 临床样本的检测和病毒分离结果

5．3．2 E2基因扩增和测序

5．3．3 E2基因核酸序列分析

5．3．4 E2基因氨基酸序列比对

5．4 讨论

第六章 结论与下一步工作展望

6．1 猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗体外效检替代方法的建立

6．2 鉴别检测猪瘟兔化弱毒和野毒的RT-nestPCR检测方法的建立和应用

6．3 鉴别检测猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和牛病毒性腹泻病毒的三重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

6．4 分离自中国北方部分地区种猪场临床健康猪的猪瘟病毒E2基因序列的分析

6．5 下一步工作展望

参考文献

致谢

作者简历