新型HSP90抑制剂抗胃癌作用及机制研究高通量筛选eIF4E抑制剂及其抗肿瘤作用研究

摘要

热休克蛋白90(Hsp90)是一种广泛存在于细胞中的分子伴侣(molecularchaperone)。它通过稳定肿瘤细胞中的原癌蛋白(例如Akt和c-Raf)从而参与多种细胞内信号转导过程。Hsp90抑制剂17-AAG在临床试验中展现出颇具希望的抗肿瘤效应，但由于其潜在的毒性和不良的药代特性，进一步的应用受到限制。因此现阶段的努力集中于开发具有更强药效和更低副作用的新型Hsp90抑制剂。本研究利用荧光偏振竞争结合实验筛选了百余种小分子化合物，并筛选出一种作用较强的间苯二酚衍生物LD053，它能与Hsp90 ATP结合口袋有效地结合。LD053与Hsp90的结合能将辅分子伴侣cdc37从Hsp90上解离下来，导致Akt和c-Raf的不稳定，并通过提高泛素化而使两者降解，进而抑制下游的PI3K/Akt和c-Raf/Mek/Erk信号通路。结果，LD053降低了BGC823肿瘤细胞的活力并诱导其凋亡，表现为细胞在subG0/G1期的积累，同时cleaved-caspase3和PARP的增多。但正常细胞对LD053并不敏感。与体外抗肿瘤活性一致，LD053能显著抑制裸鼠体内BGC823异种移植瘤的生长，而体重却未见明显降低。以上结果均表明，LD053是一种新型的Hsp90抑制剂，并具有潜力用于胃癌的治疗。
　　 近期研究表明，由eIF4F复合物起始的帽依赖的翻译过程对多种原癌蛋白的表达是必需的，这些原癌蛋白包括c-Myc，survivin，Cyclin D1，Mcl-1，VEGF等。因此帽依赖的翻译在人类肿瘤中常常是处于上调的状态。作为eIF4F复合物的重要组成部分，真核生物翻译起始因子4E(eIF4E)是帽依赖翻译的限速因子，并且经常因为基因扩增和转录上调而在肿瘤细胞中过表达。siRNA或反义寡核苷酸引起的eIF4E的表达下调能够有效地抑制肿瘤细胞的生长并诱导凋亡，而且没有明显毒性。这些结果使研究者们对开发新型的小分子药物产生了浓厚的兴趣，这些小分子药物能靶向于eIF4E驱动的翻译起始装置。基于FRT介导的同源重组，本实验室建立了一种基于荧光素酶报告体的检测方法，能够高通量地筛选抑制eIF4E表达的小分子化合物。应用该方法我们筛选了NCI Diversity-Set化合物库，筛选出一个小分子，代号为48F10，它能在较低的微摩尔浓度显著地抑制几种乳腺癌细胞eIF4E的mRNA表达，进而剂量和时间依赖性地降低HS578T细胞中eIF4E的蛋白水平，导致下游蛋白survivin，cyclin D1，Mcl-1和c-myc的下调，同时抑制乳腺癌细胞的生长，并诱导凋亡，表现为cleaved-caspase3和cleaved-PARP的明显增多。因此，48F10代表了一类新的eIF4E抑制剂，能通过抑制eIF4E的转录而抑制帽依赖的翻译。

目录

英文缩略词(Abbreviations)

第一部分 新型HSP90抑制剂抗胃癌作用及机制研究

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

1．荧光偏振竞争结合实验(FPA)对间苯二酚衍生物Hsp90结合活性的筛选

2．LD053能解离Hsp90-cdc37复合物并促进Akt和c-Raf的蛋白酶体降解

3．LD053抑制c-Raf和Akt介导的原癌信号通路

4．LD053对BGC823细胞凋亡及周期分布的影响

5．间苯二酚衍生物LD053的体外抗肿瘤活性研究

6．LD053的体内抗肿瘤活性研究

讨论

结论

参考文献

第二部分 高通量筛选eIF4E抑制剂及其抗肿瘤作用研究

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

1．通过检测荧光素酶报告体活性高通量筛选eIF4E抑制剂

2．48F10在A549细胞中对eIF4E的抑制作用

3．48F10在乳腺癌细胞中对eIF4E的抑制作用

4．48F10通过eIF4E启动子的特定区域执行转录抑制作用

讨论

结论

参考文献

综述

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