延胡索生物碱谱-效关系及相互作用研究

摘要

延胡索俗称元胡，是著名的“浙八味”之一，始载于《本草拾遗》，中国药典收载其正品来源为罂粟科(Papaveraeeae)紫堇属（Corydalis）植物延胡索（Corydalisyanhusuo W.T.Wang）的干燥块茎，是中医药学中传统的活血、行气、止痛药，应用历史悠久，在中枢神经系统、心血管系统等多方面具有显著作用。
　　到目前为止，对延胡索的研究多局限于延胡索乙素或其衍生物等叔胺碱的研究，对季铵碱成分的研究尚少报道，更未见不同类型生物碱与其功效的相关性以及相互作用研究。因此，本论文以季铵碱的抗心肌缺血活性为重点研究谱效关系。
　　本论文应用高效液相色谱技术，对40种不同产地的延胡索药材进行指纹图谱分析，并运用国家药典相似度分析软件对HPLC指纹图谱进行相似度分析，初步找出十个共有峰，还运用多种纯化分离方法和结构鉴定技术(大孔树脂、硅胶、MCI、UV、MS、1HNMR、13CNMR)对共有峰化学成分进行系统研究，从中分离得到6个化合物，分别为13-甲基巴马土宾、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢延胡索碱、脱氢紫堇鳞茎碱、黄连碱和非洲防己碱。
　　UPLC是近年来才兴起的一种具有优越的灵敏度和分离能力的分离检测技术。本论文通过优化液相分析条件，建立了延胡索不同类型生物碱的UPLC特征指纹图谱，定量了37个样品的共有峰峰面积，并对指纹图谱进行了聚类分析和相似度分析。结果表明，不同产地的延胡索质量差别比较大，其中以37号样品（产地浙江，购自北京同仁堂）为参照，发现产地浙江、四川、湖南的醋制延胡索与其相似度较高，可以聚为一类，而陕西和山东的生品与其差距最远。
　　应用UPLC-Q-TOF技术，在线快速指认和鉴定了原小檗碱型季铵碱共有峰的化学成分。
　　本论文通过MTT法，比较了37种不同产地的延胡索季铵碱对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用，得到谱效关系研究的药效学评价指标。
　　还应用多元回归分析，灰关联度分析和相关分析等化学计量学方法对37种不同产地的延胡索季铵碱的化学指纹信息和药效学指标进行了谱效关系研究。结果表明，4号峰脱氢紫堇鳞茎碱对药效贡献最大，是延胡索季铵碱中重要的活性物质;3号峰13-甲基脱氢紫堇达明碱、1号峰非洲防己碱、2号峰黄连碱、8号峰脱氢延胡索碱和6号峰巴马汀对药效也都有正向贡献作用;而5号峰13-甲基巴马土宾和7号峰小檗碱与药效相关性很低或者负相关，提示X4、X3、X1、X2、X8和X6共同构成了延胡索季铵碱抗心肌缺血的药效物质成分群。本研究为中药“谱效关系”的质控模式提供了理论依据和实践探索。
　　本论文通过测MTT对延胡索季铵碱共有峰单体化合物进行了药效学评价，并计算出8个化合物的EC50。结果表明，黄连碱、脱氢延胡索碱和非洲防己碱对于心肌细胞缺氧/复氧模拟的心肌缺血/再灌注损伤模型的药效活性最好，是延胡索季铵碱的重要活性物质;脱氢紫堇鳞茎碱，13-甲基脱氢紫堇达明碱以及巴马汀也都有显著的保护作用;而13-甲基巴马土宾和小檗碱没有明显的心肌细胞缺氧/复氧保护作用它们6种物质共同组成了延胡索季铵碱抗心肌缺血的药效物质基础。。这与多元回归分析，灰关联度分析和person相关分析的结果是基本一致的。因此，单体给药很好的验证了谱效分析方法的可靠性和准确性。
　　本论文通过小鼠热板法和扭体法对延胡索叔胺碱和季铵碱以及两者1∶1配伍给药的镇痛作用进行了比较。结果表明，对于热传导引起的中枢疼痛，叔胺碱有明显镇痛作用，季铵碱和混合组都没有明显中枢镇痛作用。对于腹腔注射醋酸导致的外周疼痛，季铵碱有明显镇痛作用，叔胺碱无明显镇痛作用，且两者混合后，对季铵碱的镇痛作用没有明显影响。
　　本论文对延胡索叔胺碱和季铵碱以及两者1∶1配伍给药对于大鼠皮下注射异丙肾上腺素造成急性心肌缺血的保护作用进行研究。实验结果表明，模型组的低剂量的季铵碱已有明显的抗心肌缺血作用，而混合组的抗心肌缺血药效要比单独的季铵碱或者叔胺碱要好，并且这种增加的药效，跟剂量是无关的，因为高剂量季铵碱组的药效指标与模型组没有明显差异，说明在抗心肌缺血方面，叔胺碱对季铵碱可能有协同作用。

目录

声明

缩略语及术语简表

摘要

前言

第一章 文献综述

第一节 中药谱-效关系的研究进展

1 指纹图谱的建立

2 谱-效关系的研究

3 应用实例

4 结语及展望

第二章 延胡索生物碱指纹图谱研究

第一节 延胡索生物碱HPLC指纹图谱的建立

1 实验材料

2 方法与结果

3 小结与讨论

第二节 季铵碱单体化合物的制备

1 实验目的

2 实验材料

3 实验步骤

4 实验结果与讨论

第三节 延胡索生物碱UPLC指纹图谱及UPLC-MS定性分析

1 实验材料

2 实验方法与结果

3 小结与讨论

第四节 总结与讨论

第三章 延胡索季铵碱药效学研究

第一节 对心肌细胞损伤保护作用方法的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二节 对缺氧／复氧导致H9C2心肌细胞损伤的保护作用

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

第三节 总结与讨论

第四章 延胡索季铵碱的谱效关系研究

第一节 多元回归分析

1 原理

2 多元回归模型

3 实验结果

4 讨论

第二节 灰关联度分析

1 原理

2 计算方法

3 求关联度以及排序

4 讨论

第三节 典型相关分析

1 原理

2 计算方法

3 实验结果

4 讨论

第四节 共有峰单体验证

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

第五节 总结与讨论

第五章 延胡索不同类型生物碱相互作用研究

第一节 季铵碱配伍对叔胺碱镇痛作用的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二节 叔胺碱配伍对季铵碱抗心肌缺血作用的影响

1 用冠脉结扎的方法建立心肌缺血再灌注模型方法考察

2 ISO建立心肌缺血模型方法考察以及季铵碱有效给药剂量的确定

3 延胡索不同功效成分组对于ISO造成心肌缺血的保护作用以及两者相互作用

第六章 总结与讨论

参考文献

附图

致谢

简历