第一部分:Sox11基因在套细胞淋巴瘤中作用机制研究;第二部分:B淋巴增殖性疾病中IGHV突变状态研究

摘要

第一部分Sox11基因在套细胞淋巴瘤中的作用机制研究 背景和目的： 套细胞淋巴瘤(MCL)是一类少见的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。t(11;14)(q13;q32)是其最主要的遗传学标志，但大约有＜5％的患者缺乏这一标志。近期研究发现性别决定基因-睾丸决定因子sox11基因在MCL中高表达且有望成为这一疾病诊断的分子标志，但其预后价值存在争议。本课题组前期研究发现与其他B-NHL相比，sox11 mRNA水平在MCL中明显增高，并且白细胞升高、12号染色体三体、MYC基因扩增和近期疗效＜PR的患者sox11表达水平明显降低，同时发现sox11mRNA高表达组的患者无进展生存(PFS)时间和总生存(OS)时间较低表达组均明显延长[1]。由此我们推测sox11在MCL中是一个预后良好标志，本研究在此基础上，进一步通过基础研究来探讨sox11基因在MCL发病机制中的作用。 研究方法： 1、构建sox11 shRNA质粒和对照质粒并瞬时转染套细胞淋巴瘤Z138细胞系，通过mRNA水平和蛋白水平的检测来筛选有效的靶点序列。 2、选用有效的靶点序列进行慢病毒包装，后感染Z138细胞系并通过流式细胞分选仪分选获得稳定感染的细胞进行培养，以便进行后续实验。 3、通过CCK8、克隆形成实验、流式细胞仪来检测sox11基因沉默以后对细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。 4、通过CCK8检测sox11基因沉默以后对硼替佐米药物敏感性的影响。 5、用western bloting检测sox11沉默以后细胞周期、凋亡相关信号通路以及MAPK信号通路相关蛋白的变化。 6、建立Z138sox11shRNA套细胞淋巴瘤细胞系的NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型，观察成瘤性的变化。 结果 1、与对照组相比，sox11沉默以后MCL细胞系的增殖活性显著增高，克隆形成能力显著增高。 2、与对照组相比，sox11沉默以后MCL细胞系细胞凋亡的比例明显减低。 3、与对照组相比，sox11沉默以后细胞周期S期的比例显著增高。 4、Sox11沉默以后P53/P21通路、caspase通路及MAPK通路的相关蛋白表达水平减低。 5、与对照组相比，sox11沉默以后细胞对硼替佐米的药物敏感性显著减低。 6、在NOD/SCID小鼠Z138 sox11 shRNA细胞系的皮下移植瘤模型中观察发现，sox11沉默以后小鼠皮下的成瘤能力明显增强。 结论： 1.体内及体外实验均发现，sox11沉默以后可以促进套细胞淋巴瘤的生长，体外实验显示sox11沉默以后可以通过抑制细胞周期相关的负性调节蛋白、细胞凋亡相关蛋白来促进细胞周期、抑制细胞凋亡，并且可以抑制MAPK/P38信号通路。由此推测sox11可能通过这些信号通路参与套细胞淋巴瘤生长、凋亡的调控。 2.本研究与我们之前的临床研究提示sox11高表达在套细胞淋巴瘤中是一个预后良好标志。 第二部分B淋巴增殖性疾病中IGHV突变状态研究 研究目的： 研究B淋巴增殖性疾病(BLPD)患者IGHV突变状态及典型模式的分布情况，并与欧洲国家报道的数据进行对比以此探讨中西方国家二者的差异。 研究方法： 对195例B-LPD患者进行回顾性研究。应用直接测序法或者克隆测序法检测IGHV的VDJ序列并进行数据库比对及聚类分析，分析BCR的典型模式，比较IGHV突变患者与未突变患者的临床及实验室特征。由于病例数的限制及目前IGHV突变的国外研究现状，我们仅对慢性淋巴细胞白血病(CLL)及脾边缘区淋巴瘤(SMZL)的数据进行上述分析。 结果： 1、在100例CLL患者中IGHV突变与未突变比例分别为74％和26％，IGHV突变比例显著高于欧洲报道(55％ vs45％)。经VDJ序列分析发现，V区V4片段的使用显著高于欧洲报道(32％ vs21％)，D区D3-3的使用频率明显低于欧洲报道(5％vs14.52％)，而D5-12片段的使用频率显著增高(12％ vs2.97％)，并且中西方患者各有不同的D区片段使用。在100例患者中只有6％的患者可归入西方国家的典型模式中，而且发现4对新的CLL患者的典型模式。IGHV突变状态与ATM基因缺失与否有关，AMT缺失的患者更多表现为IGHV未突变状态(p=0.008）。在17p未缺失组中，IGHV突变的患者所占比例更高(76％ vs24％)，但二者无明显统计学差异(p＞0.05)。与IGHV突变组相比，未突变组的免疫球蛋白IgG水平显著增高（11.35±3.85 vs9.63±3.29，p=0.048）。由于随访时间较短，该突变对于疾病进展及生存的影响仍需进一步观察，而两组患者的TTT(time to treatment)未见显著统计学差异(p=0.667)。 2、在39例SMZL中，IGHV突变患者与未突变患者的比例分别为74.4％和25.6％，与意大利报道的比例相当。在V区基因，V2-70及V4-34的使用频率高于意大利报道(10.3％ vs0.75％，15.4％ vs7.5％)，而V3-23明显减低(2.6％ vs18％)。在D区基因中，D2-21、D3-10和D6-13高于意大利报道(17.9％ vs2.3％，12.8％ vs4.5％，12.8％ vs3.8％)，而D3-3基因的使用明显减低(7.7％ vs18％)。在39例患者中发现1对新的典型模式，同时SMZL特异性的V1-2基因在我们这部分患者中频率也最高(25.6％)。与IGHV突变组相比，未突变组的免疫球蛋白IgG、IgA水平显著增高（13.7±5.36 vs10.6±2.76、1.8±0.82 vs1.19±0.65，p＜0.05），2例检测到17p缺失的患者IGHV均呈未突变状态。两组患者的TTT无明显统计学差异(p=0.258)。 结论： 1、在CLL患者中，IGHV突变比例显著高于欧洲报道，只有6％能归入西方国家报道的典型模式中，同时发现4对新的典型模式，这说明中西方国家CLL患者的IGHV突变状态存在显著差异。后结合VDJ具体基因片段分析发现造成这种差异的主要原因可能是V区和D区基因使用的频率不同导致。在IGHV未突变组中ATM基因缺失率及IgG的水平显著增高。 2、在SMZL患者中，IGHV突变比例与意大利报道相当，但V区和D区基因的使用频率仍存在差异。V1-2基因的使用呈现疾病特异性，同时发现1例新的典型模式。在IGHV未突变组中，IgG及IgA的表达水平显著增高。2例检测到17p缺失的患者IGHV均呈未突变状态。

目录

第一部分 Sox11基因在套细胞淋巴瘤中的作用机制研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 B淋巴增殖性疾病中IGHV突变状态研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述 信号通路在套细胞淋巴瘤发病机制中作用的研究进展

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