秀丽线虫胰岛素信号通路突变体的定量蛋白质组学研究

摘要

在秀丽线虫中，胰岛素信号受体蛋白DAF-2的突变可以将线虫的寿命延长将近一倍，而此长寿表型又完全依赖于叉头转录因子FoxO在线虫中的同源蛋白DAF-16的活性。这强烈暗示衰老是受到遗传机制调控的。线虫胰岛素信号通路也因此成为了最近几十年中衰老研究的主要对象之一。目前，针对线虫胰岛素信号通路开展的研究工作主要集中在单基因水平和转录组水平，对于胰岛素信号对线虫蛋白质组的整体影响仍然所知甚少。仅有的一些研究线虫胰岛素信号通路突变体蛋白质组的工作，定量数目较少，整体覆盖率低，不利于系统研究蛋白质组水平的变化。 在本工作中，我建立并优化了一整套适用于线虫样品的基于N-15稳定同位素标记的定量蛋白质组学流程。首先，根据线虫样品的特点，分别优化了样品制备方法、离线预分离方法以及色谱质谱方法。其次，引入了更为可靠的定量软件并完善了包括数据过滤以及统计分析在内的数据后处理流程。该流程具有很好的技术可重复性和生物样品可重复性，定量结果可靠性高且具有较高的蛋白质组覆盖度，提供了从线虫样品到最终定量结果的完整解决方案。我使用该流程对野生型线虫和三种胰岛素信号通路突变体线虫（daf-2，daf-2;daf-16, daf-16）的蛋白质组进行了定量研究与比较。在每个线虫品系的一次生物重复中，平均可以对超过6000个蛋白进行定量，大大超越了有记录可查的线虫蛋白组定量数量。本工作中的蛋白质定量结果与之前类似工作中的定量结果具有高度的一致性。此外，daf-2突变体线虫中的差异蛋白（与野生型相比）富集了已知的寿命调控基因，这一方面解释了daf-2突变体线虫为何具有长寿表型;另一方面则暗示通过详细研究在daf-2突变体线虫中差异表达的蛋白质，更有可能发现新的寿命调控基因。 利用此定量蛋白质组数据，我评价了DAF-16活性在重塑daf-2突变体线虫蛋白质组中的作用。分析表明，表达量在daf-2突变体线虫和野生型线虫之间存在差异的蛋白中，有且仅有约70％依赖于DAF-16的活性。与此相一致的是，在daf-2突变体线虫中表达量显著上调的蛋白质的编码基因的promoter区并不富集已知的DAF-16结合元件，尽管其中依赖于DAF-16的那一部分上调蛋白质的编码基因的promoter区可以显著富集DAF-16结合元件。有趣的是，表达量在daf-2突变体线虫中显著下调的基因，无论该下调是否依赖于DAF-16，其编码基因的promoter区均无法富集到已知的DAF-16结合元件。这指出不依赖于DAF-16转录活性或间接依赖于DAF-16转录活性的调控机制对重塑daf-2突变体线虫蛋白质组起到了至关重要的作用。 通过比较蛋白质组与转录组学数据，我发现mRNA水平的变化和蛋白质水平的变化在总体上的相关性仅为0.38（spearman相关系数），相当一部分蛋白质的表达量变化无法用其mRNA水平的变化来解释。说明转录后调控机制对重塑daf-2突变体线虫蛋白质组也起到了关键作用。进一步分析发现，相比于在mRNA和蛋白质水平都下调的基因，仅在蛋白质水平发生下调的基因拥有更长、也更易于形成二级结构的3' UTR序列。这暗示包括microRNA在内的一系列转录后调控机制可能参与了胰岛素信号对蛋白质组的重塑过程。 通过对差异表达蛋白进行深入的功能分析，我发现包括糖酵解、脂肪酸分解以及氨基酸分解在内的三大营养物质的分解产能过程在daf-2突变体线虫中得到了全面加强，而包括mRNA转录和蛋白质翻译在内的生物大分子合成过程在daf-2突变体线虫中受到了广泛的抑制。进一步的生物实验验证表明，干扰核糖体RNA的转录后修饰过程可以进一步延长daf-2突变体线虫的寿命，这很有可能是通过进一步降低蛋白质翻译过程来实现的。 网络分析表明，表达量在daf-2突变体线虫中发生变化的蛋白质在蛋白质相互作用网络中居于更加中心的位置，它们拥有更高的度和介数，与网络中其他蛋白的距离也更近。我进一步将包含了差异蛋白的子网络分解成了若干模块，对主要模块的功能进行了分析，并找到了联系不同模块的重要的蛋白-蛋白相互作用，以期对最终阐明daf-2突变体线虫差异蛋白质组的内部结构做出贡献。

目录

摘要

第一章：引言

1．1 衰老研究的背景

1．1．1 衰老研究的进化学假说时代

1．1．2 衰老研究的遗传学分析时代

1．1．3 衰老研究的系统生物学时代

1．2 定量蛋白质组学介绍及研究进展

1．2．1 蛋白质组学的工作流程

1．2．2 多肽的鉴定

1．2．3 在蛋白质组学水平进行定量研究

1．2．4 进行定量蛋白质组学实验时需要考虑的几点关键因素

1．3 本研究的目的与意义

第二章 实验材料与方法

2．1 细菌菌株

2．2 线虫品系

2．3 线虫培养

2．3．1 线虫培养基所需试剂

2．3．2 线虫生长培养基的配制方法

2．3．3 HG琼脂培养基

2．3．4 M9溶液的配制

2．3．5 LB培养基的配制

2．3．6 线虫培养方法

2．4 线虫的同步化培养

2．5 N-15标记线虫的培养方法

2．6 线虫基因组DNA的提取

2．6．1 单条线虫基因组DNA提取

2．6．2 酚氯仿抽提法大量纯化线虫基因组DNA

2．7 线虫总RNA提取以及cDNA合成

2．7．1 试剂及材料

2．7．2 线虫总RNA提取

2．7．3 使用DNaseI从提取的总RNA中去除DNA

2．7．4 第—链cDNA合成

2．8 定量real-time PCR

2．9 Feeding RNAi实验

2．9．1 实验试剂及材料

2．9．2 实验方祛

2．10 线虫寿命的测定

2．11 使用FASP方法制备线虫蛋白质组样品

2．11．1 试剂及材料

2．11．2 实验步骤

2．12 色谱柱制备

2．12．1 试剂、材料及仪器

2．12．2 离线分离柱

2．12．3 预柱

2．12．4 分析柱

2．13 样品的离线分离

2．13．1 试剂与材料

2．13．2 实验方法

2．14 高效液相色谱方法

2．15 质谱方法

2．16 蛋白质鉴定

2．17 蛋白质定量

2．18 定量数据处理

2．19 判断蛋白质表达量变化是否依赖于DAF-16活性的标准

2．20 聚类分析

2．21 Gene Ontology富集分析

2．22 Gene Set Enrichment Analysis

2．23 Promoter分析

2．24 3’UTR分析

2．25 网络拓扑特征分析

第三章 实验结果

3．1 秀丽线虫定量蛋白质组学方法的建立与优化

3．1．1 样品制备方法的优化

3．1．2 离线预分离方法的建立

3．1．3 质谱条件的优化

3．1．4 数据分析流程的特点

3．2 对胰岛素信号通路突变体线虫在蛋白质组水平上进行定量描绘

3．2．1 用作内参的线虫的N-15标记效率达到99％

3．2．2 N-14、N-15混合比例接近1∶1

3．2．3 定量蛋白质组结果概况

3．2．4 色谱与质谱方法具有很好的技术可重复性

3．2．5 样品和实验流程具有较好的生物可重复性

3．2．6 定量结果具有较高的蛋白质组覆盖率和可靠性

3．3 daf-2突变体线虫中的差异表达蛋白质富集了已知的寿命调控蛋白

3．4 DAF-16转录活性在重塑daf-2突变体线虫蛋白质组中的作用

3．5 转录后调控机制在重塑daf-2突变体线虫蛋白质组中的作用

3．6 只在蛋白质水平发生下调的基因拥有更为复杂的3’UTR结构

3．7 daf-2突变体中差异表达蛋白的功能富集分析

3．8 合成代谢过程在daf-2突变体线虫中受到广泛抑制

3．8．1 蛋白质翻译过程在daf-2突变体线虫中显著下降

3．8．2 RNA转录及剪接过程在daf-2突变体线虫中显著下降

3．8．3 蛋白酶体的组成蛋白在daf-2突变体线虫中全面下降

3．9 分解代谢过程在daf-2突变体线虫中得到全面提升

3．9．1 糖酵解途径相关的酶在daf-2突变体线虫中升高

3．9．2 脂肪酸分解途径相关的酶在daf-2突变体线虫中升高

3．9．3 多种氨基酸分解途径相关的酶在daf-2突变体线虫中升高

3．9．4 三大营养物质的分解代谢在daf-2突变体线虫中同时增强

3．10 核糖体RNA的转录后修饰过程参与寿命调节

3．11 daf-2突变体线虫中差异表达蛋白的网络拓扑特征分析

3．12 胰岛素信号通路调控蛋白的模块化分析

讨论

参考文献

附录

致谢

声明