非小细胞肺癌分子标志物的临床意义及靶向治疗相关研究

摘要

本论文以我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤——肺癌中占大多数病理类型的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)为研究对象，从表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变检测，外周血中靶向治疗疗效预测和预后相关分子标志物筛选，靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinase inhibitors，TKIs)的耐药相关基因变异筛选以及新型染色体结构维持蛋白1(chromosome region maintenance1 protein，CRM1)抑制剂对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用机制探索几个领域展开研究，内容主要分为两个部分: 第一部分:非小细胞肺癌分子标志物检测和临床意义研究 本部分研究主要针对NSCLC靶向治疗疗效预测和评价预后相关的分子标志物进行检测并分析其临床意义。首先针对EGFR基因突变进行不同标本类型以及不同检测方法的比较，确立具有临床应用价值的检测方法，进一步获得中国NSCLC患者EGFR基因突变频谱;然后以临床中最常见的外周血标本为研究对象，筛选外周血标本中与NSCLC靶向治疗疗效预测和预后相关的分子标志物，具体研究内容如下: 第一.中国NSCLC患者EGFR基因突变状态检测。本实验采用扩增阻遏突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）和直接测序法2种不同的方法检测NSCLC患者肿瘤组织和恶性胸腔积液中EGFR的基因突变状态，探讨其与临床病理学特征的关系，并比较2种检测方法的一致率。结果显示，2种方法检测37例NSCLC患者肿瘤组织标本的一致率为94.6％（Kappa=0.89，P＜0.001）;14例配对的肿瘤组织和恶性胸腔积液标本的EGFR基因突变检测结果完全一致;在417例NSCLC患者组织标本中检测到215例含有EGFR基因突变，突变率为51.6％;另外，女性患者EGFR基因突变率高于男性(55.9％ vs.42.3％，P＜0.05)。我国晚期NSCLC患者EGFR基因突变率较高;用ARMS法检测EGFR基因突变状态具有较高的敏感度，适宜用于靶向治疗患者的筛选，恶性胸腔积液可以用于EGFR基因突变检测。 第二.外周血标本中与NSCLC靶向治疗疗效预测和预后相关的分子标志物筛选。利用ARMS法检测134例NSCLC患者配对的肿瘤组织和外周血标本中EGFR基因突变状态，比较不同来源标本检测结果的一致性;应用比色法和酶联免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)法分别检测NSCLC患者外周血中循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)、转化生长因子(transforming growthfactor-alpha beta one，TGF-α和TGF-β1)的表达水平，并统计分析外周血中EGFR基因突变、cfDNA、TGF-α和TGF-β1表达水平与患者临床病理学特征以及生存时间的相关性。结果显示，NSCLC患者外周血中EGFR基因突变率为12.7％，与配对的组织标本检测一致率为59.0％（79/134，Kappa=0.19，P＜0.001），NSCLC患者外周血标本中cfDNA的表达水平高于健康对照人群(5.82 ng/μL vs.4.37 ng/μL，P＜0.05)，外周血中高表达TGF-β1的NSCLC患者EGFR-TKI的疗效较差、总生存时间较短，同时非腺癌患者外周血中TGF-β1表达水平高于腺癌患者(P＜0.05)。 第二部分:非小细胞肺癌靶向治疗相关研究 本部分研究将通过测序技术对人工构建的EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系进行检测，筛选与EGFR-TKI耐药相关的基因变异，为进一步探索EGFR-TKI的耐药机制提供依据。另外，通过体外及体内实验研究一种新型CRM1抑制剂KPT-185及KPT-276对NSCLC的抗肿瘤作用，为将来的临床试验提供理论依据。具体研究内容如下: 第一.NSCLC中EGFR-TKI耐药相关基因变异的筛选。本研究通过低浓度的EGFR-TKI持续作用，构建NSCLC耐药的细胞系，应用转录组测序（transcriptomesequencing，RNA-Seq）和单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片技术检测耐药细胞系和敏感细胞系，筛选出与耐药相关的基因变异，并用实时定量PCR技术在体外进行初步验证。结果发现在EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系中丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activation protein kinase，MAPK)信号通路的信号分子MAPK4和肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MYLK）基因过表达，可能与EGFR-TKI耐药相关。 第二.新型CRM1抑制剂对NSCLC的抗肿瘤作用研究。本研究检测了新型CRM1抑制剂KPT-185对6种NSCLC细胞系的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，并对抗肿瘤作用的机制进行探索。结果发现KPT-185对NSCLC细胞的增殖具有明显的抑制作用，半数抑制浓度(50％ inhibiting concentration，IC50)为1.3 nM-46μM。同时，该抑制剂能够诱导细胞发生G1期阻滞，并导致细胞凋亡。同时，KPT-185可以通过蛋白酶体降解CRM1，从而下调与肿瘤增殖、存活相关的蛋白表达水平，如:EGFR等;另一方面，该抑制剂可以激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartatespecific proteinase，Caspase)家族的凋亡相关蛋白，进而发挥抗肿瘤作用。我们通过建立EGFR-TKI耐药的NSCLC小鼠荷瘤模型，对KPT-185类似物KPT-276的体内抗肿瘤活性进行研究。结果显示KPT-276能够明显抑制肿瘤体积增长，延长小鼠的生存期，同时未呈现严重的毒副反应。 以上两部分研究明确了EGFR不同标本类型以及不同检测方法的检测流程，初步建立了中国NSCLC人群中EGFR基因突变频谱，以及检测了NSCLC患者外周血中与EGFR-TKI疗效预测和预后评价相关的分子标志物;同时筛选得到NSCLC中EGFR-TKI耐药相关的基因变异，通过体外及体内实验证实了新型CRM1抑制剂对NSCLC具有较好的抗肿瘤活性。通过以上研究，以期为临床指导我国NSCLC患者的靶向治疗提供可靠的理论依据。

目录

表索引

图索引

英文缩略词索引

摘要

第一部分 非小细胞肺癌分子标志物检测和临床意义研究

前言

第一章 中国NSCLC患者EGFR基因突变状态检测

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 外周血标本中与NSCLC靶向治疗疗效预测和预后相关的分子标志物筛选

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 非小细胞肺癌靶向治疗相关研究

前言

第一章 NSCLC中EGFR-TKI耐药相关基因变异的筛选

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 新型CRM1抑制剂对NSCLC的抗肿瘤作用研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

基金资助

已发表论文目录

文献综述 EGFR-TKI类靶向药物治疗非小细胞肺癌耐药机制的研究进展

致谢

个人简历

声明