野鸟禽流感监测及哺乳动物跨种传播能力评估

摘要

禽流感(Avian Influenza，AI)是由甲型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类感染疾病综合征。根据致病性不同可划分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。近几年来，屡有禽流感病毒特别是低致病性禽流感突破种间屏障作用，直接感染人类或其它哺乳动物，甚至致人死亡事件的情况发生。野鸟作为储存宿主在禽流感病毒传播中的作用一直受到高度关注:H5N1亚型禽流感随野鸟迁徙在不到两年的时间里传播到14个国家40多个地区;感染人的H7N9亚型禽流感病毒致少有2个基因节片源于野鸟携带病毒的变异;导致江西感染病例的人H10N8亚型禽流感病毒来自于野鸟。这些事件说明禽流感特别是高致病性禽流感已经严重危及到人类的健康与生命安全，并有进一步突破种间屏障引发人间流感大流行的潜在可能。在野生禽流感监测中，一方面，发达国家已将野鸟禽流感监测列入疫病监测中的常态化监测工作。中国林业局自2008年起开展了主动监测工作。因野鸟采样极为困难，国家投入相对较少，我国对野鸟禽流感的监测工作还相对落后，如2013年在发生H7N9人感染事件前，周边的日韩等国均已在野鸭中发生该病毒的前体病毒，而我国缺少相关毒株的监测，无法有效溯源。另一方面，H5、H6、H7、H9、H10等多亚型禽源病毒向人类跨种传播的现象提示我们可能有更多亚型的禽流感病毒会对人类健康构成威胁，因此，深入了解作为储存宿主的野鸟中禽流感病毒的分布情况和野鸟源病毒对哺乳动物的跨种传播作用，对于加深我们对流感病毒的认知，做好禽流感的防控工作有着重要的意义。 本研究采集了14省市48个地区的15152份野鸟样品，进行了流感病毒的分离鉴定，分离得到57株病毒，进行一步分析表明野鸟流感病毒携带率约为0.38％，秋季样品分离率高于春季。拭子样品分离率约为0.42％，粪便（环境）样品分离率为0.40％，组织样品分离率为0.18％。分离的57株病毒包括8种HA和7种NA亚型，其中H3、H4亚型为优势流行毒株，但野鸟携带高致病性H5亚型禽流感在病毒的比例较高(17.5％)，说明防控形势依然严峻。为进一步了解这些毒株的起源及与国内流行株（包括人、猪流行株）之间的关系，本研究对30株代表病毒进行了全基因测序。HA基因进化分析表明，除H3亚型具有宿主特异性外，其余亚型均存在禽、猪或禽、人或三者基因重组现象。NA基因进化关系更加复杂，但与HA进化关系无协同或一致性。相比于外部基因，内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)进化关系更是错综复杂，均存在禽、猪、人宿主间基因节片交换现象。以上结果表明野鸟是流感病毒天然的贮存库和基因库，为不同亚型或不同宿主的流感病毒提供基因片段。此外，首次在国内野鸟中分离到H13N6和H5N8病毒，提示进一步加强候鸟监测工作将有助于提前了解可能进入家禽中的病毒。 为了解这些病毒对哺乳动物的致病性，本研究以小鼠为模型对28株病毒进行感染与致病能力研究。所用的28株病毒均能在小鼠的肺脏、鼻甲骨中复制，但病毒滴度差别较大，以H5N8最高，可达105.7EID50/ml。H5N1、H5N8、H4N6、H3N2、H7、H9N2亚型毒株对小鼠均有不同程度的致死性，其中H5N8的致死率达100％，其余H3和H6亚型的病毒虽然能使小鼠感染，但并无特别的临床特征。本结果提示我们上述源于野鸟的病毒已不需要适应就可能直接感染哺乳动物。 为进一步评估毒株在哺乳动物间水平传播的能力，分别进行了受体结合特性分析和豚鼠间水平传播能力评估。受体结合特性测定结果表明H3亚型病毒均具有SAα-2，6Gal（人样流感病毒受体）结合特性，H7、H9亚型也具有一定的SAα-2，6Gal结合特性。本研究选取H3和H9亚型毒株在豚鼠间进行了接触传播研究，结果表明S89(H3N2)、ZH47(H3N3)和JL-2(H9N2)均具有一定的豚鼠间传播能力，其中以S89(H3N2)传播能力最高(2/3)。利用反向遗传学技术分析了决定S89(H3N2)与SAα-2，6Gal结合的关键位点，发现L274I影响病毒受体结合特性，表明除已发现的系列位点外，受体结合区域的其它位点同样会影响病毒受体识别能力。 为进一步分析野鸟、野生动物乃致一些家养动物携带病原体的背景，我们建立了病毒性病原体宏基因组学分析方法，结果表明，该方法无样品类型特殊性差别，对环境、组织样品均普遍适用。应用该方法首次对野鸟体内病毒种类及其丰度进行了研究，检测到多种病毒（鹅圆环病毒、雉疱疹病毒、鸭乙型肝炎病毒、鹤乙型肝炎病毒、禽流感病毒等）。在对突发大规模死亡的家养猪样品分析中发现猪流行性腹泻病毒和新型猪嵴病毒。吉林省鼠出血热监测表明，宿主动物携带的汉坦病毒仍以汉城病毒为主，其遗传进化呈现多样性。这些研究表明该方法对新型或未知病毒性病原体分析具有重要应用价值。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 野鸟与禽流感病原生态学研究

1．1 野鸟种群中禽流感病毒的分布

1．2 野鸟中禽流感病毒的遗传变异

1．3 候乌迁徙与禽流感病毒的传播

2 禽流感病毒跨种传播研究

2．1 流感病毒概述

2．2 流感哺乳动物感染模型

2．3 流感病毒哺乳动物间水平传播机制

2．4 反向遗传学技术在流感病毒中的应用

3 病毒宏基因组学研究进展

3．1 病毒宏基因组的兴起

3．2 病毒宏基因组的优势及策略

3．3 高通量测序

3．4 病毒宏基因组学在公共卫生中的应用

3．5 宏基因组学技术的机遇与挑战

第二章 野鸟禽流感监测及遗传特征分析

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器

1．3 样品采集

1．4 样品处理及鉴定

1．5 流感病毒分离

1．6 测序及进化树构建

2 实验结果

2．1 调查结果

2．2 禽流感与猪、人流感进化关系

2．3 禽流感病毒基因重组、重排

3 讨论

4 小结

第三章 应用小鼠模型评估野鸟源病毒对哺乳动物的致病性

1 材料与方法

1．1 实验毒株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 实验动物

1．5 试验方法

2 实验结果

2．1 病毒HA裂解位点

2．2 小鼠感染情况

2．3 感染小鼠病毒滴度

2．4 感染小鼠病理变化

3 讨论

4 小结

第四章 野鸟源病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估

1 材料与方法

1．1 实验毒株

1．2 实验动物及鸡胚

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 实验方法

2 实验结果

2．1 野鸟源病毒受体分析

2．2 豚鼠传播实验结果

2．3 H3N2病毒株构建

2．4 H3N2变异株受体分析

3 讨论

4 小结

第五章 病毒宏基因组学方法建立及应用

1 材料与方法

1．1 试剂及材料

1．2 主要仪器

1．3 样品制备

1．4 测序和数据分析

2 实验结果

2．1 样品检测结果

2．3 高通量测序结果

2．4 病毒分离与验证

2．5 新型猪嵴病毒变异株分析

2．6 吉林省鼠汉坦病毒进化分析

3 讨论

4 小结

结论

缩略词

参考文献

致谢

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