微生物来源的抗肺炎克雷伯菌活性菌株筛选及次级代谢产物研究

摘要

革兰氏阴性菌的耐药问题是临床抗感染治疗的一大忧患，近年由于各类抗生素的滥用，导致耐药菌株不断出现，耐药性不断增强。然而，自上世纪80年代以来，获准上市的新抗菌药物数量却在逐年减少，同时近年上市的新药在针对革兰氏阴性耐药菌感染方面未有明显进展。肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae（KPN）是重要的革兰氏阴性菌耐药病原菌，在革兰氏阴性菌临床分离检出率中位居第二，并且近10年它已成为耐药增长速率最快的肠杆菌科病原菌之一。因此研发新的抗革兰氏阴性菌的抗生素，对解决日益增长的肺炎克雷伯菌耐药问题具有重要意义。
　　微生物次级代谢产物是寻找新药的重要来源，其种类多样并且包含丰富的代谢产物结构类型，这些特性都为发现新的抗耐药菌化合物提供了可能。
　　本研究以一株产超广谱β-内酰胺酶SHV-18的肺炎克雷伯菌(ATCC700603)抑制活性为导向，对本实验室的16700株微生物（包括放线菌、细菌、真菌）的33400个发酵液样品进行活性筛选，利用微量稀释法测定其抗肺炎克雷伯菌( ATCC700603)的活性，初筛共得到93株活性菌株的101个活性发酵液样品，初筛活性菌株阳性率为0.56％。对93株活性菌株进行复筛二次发酵，采用平板纸片法进行活性测定，复筛后共得到32株活性菌株的36个活性发酵液样品，复筛活性菌株阳性率为0.20％。对其中活性较好的17个发酵液样品进一步进行抗菌谱测定，发现有4个发酵液样品I09AA-02146、I09AA-02711、I11AB-02500、I11AB-02762对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性病原菌的标准菌株以及耐药菌株均表现出良好的抑制活性。因样品I11AB-02500的活性较强，发酵活性重复性好且对产NDM-1的肺炎克雷伯杆菌ATCC BAA-2146具有良好的抑制作用，因此将菌株I11A-02500(CPCC203718)作为本研究中活性化合物研究的阳性菌株。
　　本研究对I11A-02500进行放大发酵，并对其进行了初步的次级代谢产物研究。以抗KPN(ATCC700603)活性为导向，利用正反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备HPLC等分离纯化手段，结合现代波谱学方法和文献数据鉴定化合物结构，最终获得13个化合物，鉴定了9个化合物的结构。其中2500-1、2500-10经微稀释法测定均显示出抗肺炎克雷伯菌活性，MIC分别为512μg/mL、16μg/mL。

目录

声明

摘要

缩略语一览表

前言

实验材料

1．菌株

1．1 测试菌株

1．2 筛选菌株

2．主要培养基

2．1 测试培养基

2．2 斜面培养基

2．3 发酵培养基

3 主要试剂

4 主要仪器

实验方法

一、抗肺炎克雷伯菌活性菌株的筛选

1．初筛

2．复筛

3．抗菌谱测定

4．化学组成活性评价

二．放线菌I11A-02500(CPCC 203718)次级代谢产物的分离纯化以及抗肺炎克雷伯菌的活性研究

1．I11A-02500菌株发酵条件摸索及发酵液活性稳定性评价

2．菌株I11A-02500放大发酵及其代谢产物分离纯化

实验结果与讨论

一、抗肺炎克臂伯菌活性菌株的筛选

1．初筛结果

2．复筛结果

3．抗菌谱测定

4．化学组成活性评价

5．活性目标菌株的选择

二、放线菌I11A-02500(CPCC 203718)次级代谢产物的分离纯化以及抗肺炎克雷伯菌的活性研究

1．菌株I11A-02500的摇瓶发酵

2．菌株I11A-02500发酵液分离纯化中抗肺炎克雷伯菌活性跟踪

3．化合物结构式

4．化合物结构鉴定

5．讨论

结论

参考文献

附图

致谢