外伤性脑损伤模型大鼠中经颅磁刺激对内源性神经干细胞作用的研究

摘要

研究背景和目的： 外伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)在所有人群中都很常见，不分年龄、背景或健康状况。时代发展使得交通事故愈加频繁，TBI必然会成为我国一个沉重的公共卫生问题。影响TBI患者功能恢复的最大障碍是脑实质缺失。虽然脑损伤时机体内源性神经干细胞会增殖，但增殖水平有限且增殖后的存活率很低。促进内源性神经干细胞增殖和存活或许是治疗TBI的一个可行策略。 经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation，TMS)是一种无创脑刺激(noninvasive brain stimulation，NBS)技术，通过激活神经元或改变神经元兴奋性而发挥神经调控作用。在恰当的参数下，TMS能影响大脑局部血流，改变局部氧化应激水平，调节神经再塑(neuroplasticity)。另外，有研究提示TMS具有促进神经再生的能力。基于TMS已知的多种作用，结合TBI的病理生理过程，可得出TMS具有治疗TBI潜能的推论。但至今没有用TMS治疗TBI的研究发表，也没有专门的研究探讨TMS是否能影响TBI后内源性干细胞增殖。 本研究尝试用重复经颅磁刺激(rTMS)治疗中度TBI大鼠，重点观察大脑内源性神经干细胞增殖情况。 方法： 成年雄性SD大鼠，体重210-260g，用Feeney自由落体打击法造成中度TBI。用改良神经功能缺失评分(mNSS)评价大鼠PO1、PO7、PO14和PO28的行为学表现。根据PO1行为评分，将大鼠分层随机分为对照组和经颅磁刺激组（TMS组）。从PO2开始行TMS，参数如下:电压700V，频率5Hz，TMS组每只大鼠每日接受900个脉冲刺激。在PO7、PO14、PO28三个时间点将大鼠分批处死，生理盐水和4％多聚甲醛心脏灌流后取脑，石蜡包埋切片，进行HE和免疫组化染色。利用HE切片测定冠状面脑组织面积，以此计算损伤侧脑组织相对健康侧的减少率。免疫组化染色指标包括细胞增殖标志物BrdU，神经干细胞标志物musashil，成熟神经元标志物NeuN，细胞凋亡标记物caspase-3。少数在PO14处死的大鼠(n=5)取脑后单独剥离SVZ行免疫荧光染色，染色指标包括BrdU、DAPI、DCX（神经元前体细胞标志物）和laminin（血管标志物）。BrdU、NeuN、caspase-3和DCX染色情况用视野内的阳性细胞数评价（阳性细胞密度），musashil用视野内阳性面积占全部脑组织面积的比例评价（阳性面积比）。部分大鼠在PO2和PO13行18F-FDG micro-PET。 结果： (1)TMS组意外死亡率有明显低于对照组的倾向(15.79％ vs37.14％，p=0.09)。 (2)大鼠的mNSS评分在损伤后PO1-PO14逐渐改善，TMS组vs对照组，PO7的评分近似(7.00±1.27 vs6.20±1.92),而PO14评分有TMS组明显更低的倾向(3.38±1.47 vs5.40±1.14,p=0.085)。 (3)外伤性脑损伤后大鼠损伤侧大脑半球的脑组织相对减少率逐渐提高，其中PO28时TMS组有明显低于对照组的倾向(32.80±3.0％ vs38.59±3.2％，p=0.083)。 (4)免疫组化染色中，两组损伤侧脑室背外角的BrdU阳性细胞密度在三个时间点均无显著差别;损伤侧脑室背外角musashil阳性面积比从PO7到PO28逐渐减少，两组间比较，对照组PO7时高于TMS组，而PO14和PO28时低于TMS组，差别都不具有统计学意义;两组损伤灶周边区NeuN阳性细胞密度在三个时间点均无显著差别;损伤灶周边Caspase-3阳性细胞密度，三个时间点对照组的平均值都低于TMS组，其中PO14时有对照组明显低于TMS组的倾向(p=0.062)。 (5) PO14取SVZ进行的免疫荧光染色中，对照组BrdU和DCX阳性细胞密度平均值都低于TMS组，差别没有统计学意义。 (6) PO2时，对照组和TMS组损伤侧大脑皮层和纹状体代谢水平都较正常侧减低;PO13时，两组损伤侧皮层代谢水平都接近于正常侧，而纹状体代谢水平都较正常侧升高。对照组和TMS组之间比较无明显差别。 结论： 对于遭受中度TBI的大鼠，TMS表现出了以下有利趋势:(1)明显降低大鼠TBI后死亡率的趋势，(2)明显改善TBI后行为恢复的趋势，(3)明显减少TBI后损伤侧脑实质丢失的趋势，这些结果与基于已有研究结果和TBI病理生理作出的推论相符，但对于另一个推论，即促进TBI后内源性神经干细胞增殖，本研究结果不能作为支持。TMS对刺激停止后24h的脑局部代谢无明显影响。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．实验试剂

2．溶液配制

3．实验器材

4．实验方法与步骤

4．1 实验动物

4．2 大鼠外伤性脑损伤模型制作

4．3 经颅磁刺激

4．3 行为学评分及分组

4．5 脑组织石蜡切片

4．6 伊红-苏木素(HE)染色和冠状面脑实质面积测算

4．7 免疫组化染色

4．8 免疫荧光染色

4．9 Micro-PET

4．10 数据统计和分析

结果

1．大鼠TBI后意外死亡情况

2．行为学比较

3．TBI后损伤侧大脑半球相对脑实质减少情况

4．Micro-PET评价的脑代谢情况

5．免疫组化

6．免疫荧光

讨论

结论

参考文献

综述一 经颅磁刺激的原理、神经生理机制及应用

镱述二 神经调控与神经再生

翻译和总结 外伤性脑损伤的病理生理

英文缩略词表

致谢

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