云南省静脉注射吸毒人群中HCV感染的分子流行病学研究

摘要

丙型肝炎(Hepatitis C)是威胁人类身体健康的重要传染病，其病原体是丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)，全球范围内大约有1.7亿人感染了HCV，我国的感染率约为3.2％。HCV感染容易慢性化，慢性丙型肝炎约有20％-30％会在20年内缓慢进展为肝硬化和肝癌，HCV感染成为导致肝癌及终末期肝病的重要原因。HCV的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)缺乏校对功能，使得RNA在复制过程中错配率极高，最终导致了HCV基因组中核苷酸突变频率极高，为基因分型提供了基础。HCV可分为6个主要基因型，每个基因型又可分为若干亚型，HCV基因型的不同直接影响HCV的致病力和患者对药物治疗的反应性。 在静脉注射吸毒人群中HCV的感染比例极高(15.6％-98.7％)，云南省地处中国西南边陲，与缅甸、老挝、越南三国接壤，紧邻世界最大的鸦片种植地“金三角”，是毒品运输入中国内地的重要节点，具有大量的吸毒人员。相关调查显示云南省静脉注射吸毒人群HCV的感染率接近80％。本研究从昆明市疾病预防控制中心获得了100份2012年1月至5月期间收集于云南不同地区吸毒人员的HCV阳性血清样本，通过RT-PCR扩增得到HCV C/E1区段，经过T-A克隆和测序，确定了云南省共分布8个亚型的HCV(1a、1b、3a、3b、6a、6n、6u、6v)。主要流行的基因型为6型(47％)，其次为3型(41％)及1型(12％)。在亚型分布中，6n亚型(30％)及3b亚型(29％)为主要流行的亚型，占到样品总数的59％。本研究通过对比云南省与其他地区静脉注射吸毒人群HCV基因型分布情况后发现，云南省HCV基因型分布情况与中国南部的情况相似，而与中国东部地区有明显区别。通过对比本次研究的结果与早前云南省相关研究的结果，发现在五年时间内云南省静脉注射吸毒人群中6型HCV比例由25％上升为47％，其中6a亚型由5％上升为15％，6n亚型由11.2％上升为30％，而3a亚型及1b亚型的频率下降接近50％。本研究的结果进一步佐证了HCV的基因型及基因亚型受到贩毒路线的影响这一推论，并发现云南省静脉注射吸毒人群中HCV基因型及基因亚型相较之前有了明显的变化，6a及6n亚型可能由缅甸和越南通过贩毒路线传入云南。

目录

摘要

1．引言

1．1 HCV的基因组结构及编码产物

1．1．1 HCV的基因组结构

1．1．2 病毒蛋白的结构与功能

1．2 HCV的传播途径

1．2．1 血液传播

1．2．2 性传播

1．2．3 垂直传播

1．3 HCV基因分型

1．3．1 HCV的基因分型系统

1．3．2 全球HCV的流行与进化

1．3．3 我国静脉注射吸毒人群中HCV的流行与进化

1．3．4 HCV基因分型的意义

1．3．5 HCV基因分型的方法

2．研究目的及意义

3．材料和方法

3．1 血清样品

3．2 主要试剂及材料

3．3 主要仪器设备

3．4 软件

3．5 引物设计及主要参考序列

4．实验方法

4．1 病毒基因组RNA的提取

4．2 逆转录反应获取HCV cDNA

4．3 分型区段的选择及PCR反应条件摸索

4．4 PCR扩增HCV C／E1区的部分序列

4．5 琼脂糖凝胶电泳

4．6 PCR产物的纯化

4．7 受体菌DH5a的感受态制备

4．8 纯化产物于PMD19-T载体的连接

4．9 转化感受态细胞DH5a

4．10 阳性重组质粒的提取及鉴定

4．11 数据分析

5．实验结果

5．1 HCV分型扩增区段地选择及PCR条件优化

5．2 阳性样本中HCV RNA的PCR检测

5．3 HCV C／E1区段的PCR扩增

5．4 PCR产物胶回收、测序用重组载体PMD19-T的构建与鉴定

5．5 HCV阳性样本中HCV C／E1区段测序结果

5．6 云南省静脉吸毒人群中HCV的基因型分布

5．7 云南省静脉吸毒人群HCV感染亚型的性别及年龄分布

5．8 云南省静脉吸毒人群中HCV的基因型分布状况与其他地区分布状况的对比

5．9 云南省静脉吸毒人群中现有HCV的基因型分布状况与早期研究的对比

6．讨论

7．小结

参考文献

附录一 HCV阳性样品测序序列

附录二 主要缩略词表

附录三 主要溶液配制方法

致谢

研究生简历

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