TAT/壳聚糖修饰多壁碳纳米管药物递送系统的研究

摘要

纳米技术的发展，实现了抗癌药物更加有效的靶向输送，使药物定向富集于病变组织、器官、细胞，从而更有效地杀伤肿瘤，并将对正常组织的毒性降到最小。功能化碳纳米管(Functionalized Carbon Nanotubes，f-CNTs)由于其独特的功能和特性，在生物医学领域具有很好的应用前景，特别是功能化碳纳米管可作为基因或药物递送的有效载体。但是，作为基因或药物载体应用，碳纳米管在水溶液中分散性较差，并且容易发生聚集，在一定程度上限制了碳纳米管在生物医学领域的应用，因此其分散性及聚集现象的改善具有重要的研究意义。同时，在碳纳米管递送的过程中，高的细胞摄入率和良好的生物安全性至关重要。
　　本论文通过壳聚糖和TAT多肽对多壁碳纳米管进行修饰，研究新型功能化碳纳米管载体。壳聚糖较好的水溶性、生物相容性及可降解性，可以通过表面吸附作用修饰于碳纳米管，在大大提高碳纳米管分散性的同时，既不会损伤碳纳米管独特的物理特性如光热性能，又可以进一步交联特异性靶向分子，如单克隆抗体、多肽及糖类等。
　　本研究通过共价修饰的方法将TAT多肽交联于低分子量壳聚糖上(TAT-CS，TC)，并以其做为多壁碳纳米管的分散剂，利用TAT多肽的强穿膜效应来进一步提高碳纳米管的的分散性、生物相容性及细胞摄入，降低碳纳米管的细胞毒性。同时，研究还将通过体内外实验探讨该功能化的多壁碳纳米管作为siRNA递送载体的可行性，以进一步拓展碳纳米管在生物领域的应用。具体研究分为以下三部分内容:
　　1、TAT-CS(TC)修饰MWCNTs的制备及表征
　　通过双官能偶联剂SPDP将TAT多肽交联到低分子量壳聚糖分子上，通过核磁共振氢谱分析TAT-CS共聚物，结果显示TAT在壳聚糖分子上的取代度约为4.1％。通过物理吸附作用实现TAT-CS(TC)对多壁碳纳米管的分散，显示当碳纳米管与TC或者CS的质量比≥10∶1时，碳纳米管可以充分的均匀分散于TC溶液或是CS溶液中。透射电镜观察修饰后的MWCNTs分散性更好，而形貌上无显著性改变。通过红外光谱及拉曼光谱检测确认TC对MWCNTs的修饰，TGA分析CS和TC在MWCNTs-CS和MWCNTs-TC产物质量中分别占有58.54 Wt.％ and59.79 wt.％。Zeta电位分析MWCNTs-TC和MWCNTs-CS的平均zeta电位为47.7±1.96和46.1±1.83，远远高于未修饰MWCNTs(13±1.32)，说明壳聚糖所带的正电荷大大提高了碳纳米管的zeta电位值，这不仅使得碳纳米管溶液可以更加稳定，而且增强的正电荷也更利于细胞对碳纳米管的摄入。
　　2、MWCNTs-TC作为siRNA递送载体的体外细胞学研究
　　MWCNTs-TC和MWCNTs-CS与不同的细胞相互作用后，通过激光共聚焦显微镜观察到两者都能够进入细胞，且主要分布于胞浆内。进一步通过流式细胞仪分析，细胞对MWCNTs-TC的摄入要远远高于MWCNTs-CS，平均荧光强度约为MWCNTs-CS的25倍，说明TAT的修饰使细胞对碳纳米管的摄入大大提高。同时，我们的研究证实MWCNTs-TC可以更加有效的的携带siRNA进入细胞内部。细胞毒性实验证实，MWCNTs-TC细胞毒性要小于MWCNTs-CS和MWCNTs。另外，我们还就MWCNTs的免疫毒性进行了初步探讨，通过MWCNTs与巨噬细胞的相互作用发现，碳纳米管本身对巨噬细胞的毒性呈剂量依赖性，但并没有引起其分泌IL-1β，IL-10，IL-12和TNF-α四种细胞因子量的改变。通过巨噬细胞吞噬率及吞噬指数的分析，发现多壁碳纳米管引起巨噬细胞吞噬活性的增强。而细胞内活性氧检测显示，碳纳米管浓度较大时，细胞内ROS水平显著增加，说明多壁碳纳米管可诱导巨噬细胞发生氧化应激反应。
　　3、MWCNTs-TC的体内分布
　　将荧光标记的MWCNTs-TC通过尾静脉给药注入小鼠体内，观察在注射后24、48及72h其在各组织器官及肿瘤的聚集情况。活体成像结果显示，尾静脉注射后24h，MWCNTs-TC组裸鼠在肾脏和肿瘤组织中观察到强烈的荧光信号，虽然随着时间的延长，组织内荧光强度在不断减弱，但在注射后48和72h，仍能在肾脏和肿瘤组织内看见荧光。MWCNTs-CS组，只有24和48h后，在肾组织内观察到荧光。器官及肿瘤成像结果显示，注射24和48h，MWCNTs-TC组的肝、肺及肿瘤组织中荧光强度较MWCNTs-CS组要强，而在心脏和脾脏中并没有观察到荧光。两组中肾脏内荧光强度都很强，提示碳纳米管也是主要通过泌尿系统排出体外。72h，MWCNTs-TC和MWCNTs-TC组中都是只有肾脏有较强的荧光信号，两组肝脏和肿瘤组织内荧光强度没有显著差别。研究分析，通过TAT的穿膜作用，使碳纳米管通过被动靶向效应大量聚集于肿瘤组织。但以MWCNTs-TC负载siRNA进行体内实验，观察到碳纳米管对荧光标记的siRNA荧光淬灭作用很强，所以并没有在体内看到任何荧光信号。
　　综上所述，利用具有强穿膜效应的TAT多肽对低分子量壳聚糖进行修饰后，将其作为多壁碳纳米管的分散剂，可以显著提高碳纳米管的分散性及细胞摄入率，降低碳纳米管的细胞毒性。体内实验证实该功能化的碳纳米管主要聚集于肿瘤部位及肝脏，并最终通过泌尿系统排出体外，这些发现对于将碳纳米管作为基因载体的研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 碳纳米管及其功能化

1．1．1 纳米技术及碳纳米管简介

1．1．2 碳纳米管的功能化

1．2 功能化碳纳米管的应用

1．2．1 功能化碳纳米管作为抗癌药物载体

1．2．2 功能化碳纳米管作为基因载体

1．2．3 功能化碳纳米管作为多肽抗原、蛋白等载体

1．2．4 功能化碳纳米管在肿瘤热疗中的应用

1．2．5 其他应用

1．3 碳纳米管的生物安全性

1．3．1 碳纳米管进入细胞的途径

1．3．2 碳纳米管毒性

1．3．3 影响碳纳米管毒性的因素

1．3．4 碳纳米管的免疫效应

1．4 细胞穿膜肽的应用

1．4．1 细胞穿膜肽的定义

1．4．2 TAT多肽

1．4．3 MPG多肽

1．5 课题的提出

第二章 TAT-壳聚糖修饰多壁碳纳米管的合成与表征

2．1 引言

2．2 实验部分

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验设备及耗材

2．2 实验方法

2．2．1 TAT多肽的设计与合成

2．2．2 TAT多肽修饰壳聚糖共聚物(TAT-CS，TC)的合成

2．2．3 TC核磁波谱分析

2．2．4 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS的制备

2．2．5 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS透射电子显微镜分析

2．2．6 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS核磁波谱分析

2．2．7 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS红外光谱分析

2．2．8 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS拉曼光谱分析

2．2．9 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS热失重分析

2．2．10 MWCNTs-TC及MWCNTs-CS的Zeta电位分析

2．3 实验结果

2．3．1 TAT多肽表征

2．3．2 核磁波谱分析

2．3．3 透射电子显微镜分析

2．3．4 红外光谱分析

2．3．5 拉曼光谱分析

2．3．6 热失重分析

2．3．7 Zeta电位分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 TAT-壳聚糖修饰多壁碳纳米管的体外细胞学研究

3．1 引言

3．2 试剂和仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验设备

3．2．3 实验试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 碳纳米管溶液的制备

3．3．2 功能化多壁碳纳米管的荧光标记

3．3．4 MWCNTs-TC的细胞毒性检测

3．3．5 激光共聚焦成像

3．3．6 通过流式细胞仪检测细胞对碳纳米管的摄入情况

3．3．7 凝胶阻滞

3．3．8 siRNA摄入情况

3．3．9 多壁碳纳米管与巨噬细胞的相互作用

3．3．10 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 MWCNTs-CS较MWCNTs-TC的细胞毒性研究

3．4．2 激光共聚焦显微镜观察碳纳米管摄入情况

3．4．3 流式细胞仪观察碳纳米管摄入量

3．4．4 功能化碳纳米管对siRNA的包载效率

3．4．5 细胞对siRNA的摄入

3．4．6 多壁碳纳米管与巨噬细胞相互作用

3．5 讨论

3．6 小结

第四章 TAT-壳聚糖修饰多壁碳纳米管的动物学评价

4．1 引言

4．2 试剂和仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验设备及耗材

4．3 实验方法

4．3．1 人乳腺癌裸鼠皮下模型的建立

4．3．2 荧光标记碳纳米管的制备

4．3．3 实验动物分组及功能化碳纳米管给药

4．3．4 功能化碳纳米管负载荧光标记siRNA的制备及给药

4．3．5 活体荧光成像

4．3．6 组织病理学

4．4 实验结果

4．4．1 TC及MWCNTs-TC的体内分布

4．4．2 功能化多壁碳纳米管在动物体内的分布情况

4．4．3 MWCNTs-TC负载siRNA在体内的分布

4．4．4 HE染色

4．5 讨论

4．6 小结

全文总结

参考文献

博士期间论文及专利

致谢