内含不同类型RNA的重组MS2噬菌体病毒样颗粒的表达及其应用研究

摘要

H7N9禽流感病毒是一种新亚型流感病毒，于2013年3月在我国上海和安徽两地率先发现。H7N9禽流感病毒感染后的死亡率较高，因此对该病毒早期准确的诊断成为挽救患者生命的关键。
　　作为一种RNA病毒，H7N9禽流感病毒的实验室检测包括病毒核酸提取、逆转录和扩增等多个步骤，每一步操作不当均会导致检测出现假阳性或假阴性结果，误导临床诊断，延误患者的治疗。为了提高全国医院实验室和流感监测网络实验室H7N9禽流感病毒的检测能力，2013年7月卫生部临床检验中心组织了一次室间质量评价。我们制备了基于MS2噬菌体病毒样颗粒(Bacteriophage MS2 virus-likeparticles，MS2 VLPs)的内含H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、基质蛋白(Matrix protein，MP)和核蛋白(Nucleoprotein，NP)四种蛋白全长RNA序列的质控品，向全国参与H7N9病毒检测的医院实验室和流感监测网络实验室发放，以评价参评实验室H7N9禽流感病毒的检测能力，指导实验室提高检测水平。所发放的样本盘含有10个样本，其中包括6个含不同浓度H7N9禽流感病毒基因的阳性样本和4个H7N9阴性样本（包括1个MP基因阳性的样本）。样本盘发放到全国79家进行H7N9禽流感病毒分子检测的实验室，并根据实验室H7和N9两个基因的检测情况对结果进行了分析。我们共收到80份回报结果（其中一家实验室回报了2份结果），其中77份结果采用real-time RT-PCR方法进行检测:60份采用商品化试剂盒检测，17份采用实验室自配试剂检测;还有3份结果采用等温扩增法检测。统计结果显示82.5％的实验室能够正确检测不同浓度的H7N9禽流感病毒样本及阴性样本。但是仍有17.5％的实验室需要改进检测能力，有待改进的实验室中大部分漏检了相对较低浓度的N9基因。总体检测的假阴性率为5.6％，假阳性率为0.6％，选用不同的检测试剂盒和检测方法得山的结果不尽相同。本次室间质量评价的结果表明我国大多数核酸检测实验室具备了H7N9禽流感病毒核酸检测的能力。
　　MS2 VLPs不仅能够包装外源mRNA，还可以用于miRNAs前体的包装，用来作为miRNAs的递送载体。在第二部分中，我们通过对MS2 VLPs表达质粒进行改造，制备了表面展示细胞穿透肽HIV-1 TAT且内含miR-122前体的重组MS2VLPs—TAT-MS2-miR122 VLPs，进一步实验结果显示TAT-MS2-miR122 VLPs能够携带miR-122前体进入Hep3B肝癌细胞系，在细胞内加工成成熟的miR-122，使Hep3B细胞内miR-122表达水平升高，高表达的miR-122通过对肿瘤相关靶蛋白的调节发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。这一部分中我们将两条重复的MS2噬菌体衣壳蛋白编码序列串联组成单链二聚体，并在单链二聚体序列的N端插入带有连接臂的穿透肽HIV-1 TAT的cDNA序列，随后把这一嵌合序列构建到真核表达质粒pESC-URA的Gal10启动子下游;将与包装位点序列串联的pre-miR-122序列构建到Gal1启动子的下游，构建完成的表达质粒转化到酿酒酵母细胞中，摇菌表达得到TAT-MS2-miR122 VLPs。结果显示采用不同剂量的TAT-MS2-miR122 VLPs处理三种不同类型的细胞，均检测到miR-122表达水平不同程度的升高，可持续稳定约120小时。TAT-MS2-miR122 VLPs处理Hep3B细胞后，伴随着miR-122水平的升高，Western Blot检测到miR-122的两个靶蛋白胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor1 receptor, IGF1R)和去整合素样金属蛋白酶10(Adisintegrin and metalloproteinase10，ADAM10)表达水平下降。IGF1R和ADAM10均在肝细胞癌的发生发展过程中发挥重要作用，两种蛋白表达下降将影响Hep3B细胞的生长。细胞增殖和凋亡实验的检测结果证实了TAT-MS2-miR122 VLPs处理的细胞与阴性对照组相比，细胞增殖明显受到抑制、凋亡细胞数显著增多，可见升高的miR-122发挥了抗肿瘤细胞生长的作用。综上所述，体外实验的结果表明展示穿透肽HIV-1 TAT的重组MS2 VLPs是有效的miRNAs递送载体，该方法制备简单、成本低、产物稳定、细胞摄取率高，具有良好的应用前景。TAT-MS2-miR122 VLPs介导的miR-122升高能否在动物水平抑制肿瘤生长有待进一步研究。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一部分 内含H7N9禽流感病毒mRNA的MS2噬菌体病毒样颗粒用于病毒核酸检测室间质量评价的研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．内含HA、NA、MP和NP mRNA的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．4．重组病毒样颗粒的耐酶性实验

2．5．重组病毒样颗粒的稳定性实验

2．6．以重组病毒样颗粒作为样本的室间质量评价

3．讨论

参考文献

第二部分 内含pre-miR-122的MS2噬菌体病毒样颗粒介导miR-122的胞内转运及其在肝癌中治疗作用的研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．转化酿酒酵母细胞后筛选阳性克隆

2．2．重组病毒样颗粒最佳表达条件的探索

2．3．最佳条件下重组病毒样颗粒的表达及其纯化

2．4．重组病毒样颗粒的鉴定

2．5．FITC标记的重组病毒样颗粒转入细胞后荧光检测

2．6．重组病毒样颗粒介导的细胞内miR-122水平升高

2．7．重组病毒样颗粒的细胞毒性实验

2．8．重组病毒样颗粒介导的miR-122水平升高对靶基因的抑制作用

2．9．重组病毒样颗粒介导的miR-122水平升高诱导Hep3B细胞凋亡

3．讨论

参考文献

论文综述 MS2噬菌体病毒样颗粒的表达及应用研究进展

附录

致谢

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