敬钊缨毛蜘蛛毒素-V对LTP和认知行为改善作用的分子机制研究

摘要

LTP自发现以来即被公认为学习记忆的分子模型，药物成瘾实则为一种异常的学习记忆，病理性学习记忆过程。在前期的试验中，我们发现JZTX-Ⅴ对戒毒具有明显作用，鉴于LTP与学习记忆之间千丝万缕的联系，近年来，我们开展了系列JZTX-Ⅴ对LTP和认知行为作用及其分子作用机制的研究。本研究分为四个部分:
　　第一部分 JZTX-Ⅴ对大鼠海马齿状回LTP的影响
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ对大鼠海马齿状回LTP的影响
　　方法: 大鼠采用乌拉坦麻醉，待其深度麻醉后，将头部固定在脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱确定侧脑室、DG及PP区位置，用颅钻按照上述位置在大鼠脑上打孔，分别用来放置给药导管、记录电极R和刺激电极S。以刺激间隔0.033 Hz的刺激方波记录基础刺激。基础刺激波形稳定30 min后，给予高频刺激诱导LTP形成，并研究10nM和100 nM JZTX-Ⅴ对LTP不同时期的作用
　　结果: 10nM和100 nM的JZTX-Ⅴ对LTP的基础传递期与空白组相比没有统计学差异，但是对LTP的诱导期与空白组相比都有明显的统计学差异(P＜0.01)
　　结论: JZTX-Ⅴ对海马DG区突触传递有显著的增强作用
　　第二部分 JZTX-Ⅴ对Aβ和东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用研究
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ对Aβ和东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用
　　方法: Aβ模型组:小鼠分为4组（对照组、Aβ模型组、JZTX-Ⅴ给药组、阳性药多奈哌齐组），模型组、JZTX-Ⅴ给药组和阳性药物组连续3天通过侧脑室给予Aβ1-42400 pmol/5μl进行造模，其余组别正常给药;东莨菪碱模型组:小鼠分为5组(对照组、东莨菪碱模型组、阳性药多奈哌齐组、JZTX-Ⅴ给药组(0.024μm和0.0024μm)，模型各组小鼠水迷宫试验训练前20分钟腹腔注射东莨菪碱0.5mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。手术恢复7天后，第八天开始给药。阳性药组每天灌胃给予5 mg/kg多奈哌齐，其余各组给予同剂量的双蒸水。JZTX-Ⅴ组侧脑室给予JZTX-Ⅴ，其余各组侧脑室给予等体积的盐水。Morris水迷宫试验末次给药7天后进行。
　　结果: Morris水迷宫实验结果显示:不论是Aβ1-42模型组还是东莨菪碱模型组在定位航行实验和空间探索实验的各项指标与空白组相比有统计学意义(P＜0.01），小鼠表现出明显的空间学习记忆障碍。定位航行实验中，盐酸多奈哌齐组的实验指标与模型组相比明显缩短(P＜0.05); JZTX-Ⅴ的实验指标与模型组相比明显缩短(P＜0.05)。
　　空间探索实验中:与空白组相比，Aβ1-42和东莨菪碱模型组小鼠在原平台所在象限的游程、时间比率、路程比率明显减少。不论是阳性药物组还是JZTX-Ⅴ组在原平台所在象限的游程、路程比率与模型组比明显增加(P＜0.05)。
　　结论: JZTX-Ⅴ对Aβ和东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍有改善作用
　　第三部分 JZTX-Ⅴ对海马CA1区瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的作用研究
　　目的: 采用红外脑片膜片钳全细胞记录方法，利用急性脑片，观察JZTX-Ⅴ对小鼠海马CA1锥体神经元A型钾电流变化的影响，以探索JZTX-Ⅴ对LTP和认知行为改善作用的分子机制。
　　方法: 选取出生两周左右的KM小鼠制备海马脑片，通过红外脑片膜片钳全细胞记录，负压破膜建立全细胞电压钳模式，钳制细胞膜电位在-60 mV，在维持上述电压的基础上给予去极化电刺激，可诱使离子通道开放记录电流，玻璃电极的电阻2-8 MΩ。脑片置于持续灌流的通以混合氧的ACSF液中，通过重力灌流系统给予急性工具药及测试药物，通过EPC-10膜片钳系统记录JZTX-Ⅴ对小鼠海马CA1锥体神经元瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流及其激活、失活等特性的变化。
　　结果: 500 nM和1 uM JZTX-Ⅴ对小鼠海马CA1锥体神经元全细胞A型钾电流与空白组比较均有抑制作用，具有统计学意义。而1 uM JZTX-Ⅴ对海马的延迟整流钾电流与空白组比较没有统计学差异;1 uM JZTX-Ⅴ与空白组比较能使小鼠海马CA1锥体神经元全细胞A型钾电流的激活及失活曲线向去极化方向漂移不同的程度，改变了A型钾通道的动力学特征，但对延迟整流钾通道的激活曲线没有影响。
　　结论: 1 uM的JZTX-Ⅴ对海马CA1区锥体神经元IA电流大小有抑制作用，使IA通道的激活及失活曲线都向去极化方向移动，我们推测JZTX-Ⅴ对海马LTP的促进作用有可能与其对A型钾电流的调控有关。
　　第四部分 JZTX-Ⅴ对大鼠脑中Kv4.2及KChIP2表达和内化迁移的作用研究
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ对Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表达及内化迁移的影响，以探索JZTX-Ⅴ对LTP和认知行为改善作用的分子机制。
　　方法: 采用梯度离心方法分离细胞膜和内涵体，研究JZTX-Ⅴ对Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表达及内化迁移的影响。以Na/K-ATPase作为细胞膜的标志蛋白，采用EEA1标志内涵体。大鼠连续10天侧脑室置管给予100 nM JZTX-Ⅴ，给药结束后断头取脑，分离海马及皮层。通过Western Blot技术，研究JZTX-Ⅴ对Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表达及内化迁移的影响。
　　结果: 大鼠连续10天给予100nM JZTX-Ⅴ后，Kv4.2在皮层各部分如H1、P1、P2、S2中与空白对照组相比都没有明显变化(P＞0.05，n=3); KChIP2在皮层各部分如H1、P2、S2中与空白对照组相比都没有明显变化(P＞0.05，n=3)，但在P1组分中与空白对照组相比明显增加(P＜0.01，n=3); Kv4.2在海马各部分如H1、P1、P2、S2中与空白对照组相比都没有明显变化(P＞0.05，n=3);KChIP2在海马各部分如H1、P1、P2、S2中与空白对照组相比也都没有明显变化(P＞0.05，n=3)。
　　结论: 海马结构中显示JZTX-Ⅴ对Kv4.2及KChIP2表达及内化迁移与空白组比较无统计学差异;皮层中JZTX-Ⅴ对Kv4.2表达及内化迁移与空白组比较无统计学意义，与空白组比较对KChIP2表达有增强作用，但对其内化迁移无作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(Abbreviation)

前言

参考文献

第一章 JZTX-V对大鼠海马齿状回LTP的影响

材料和方法

参考文献

第二章 JZTX-V对Aβ和东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用研究

材料和方法

参考文献

第三章 JZTX-V对海马CA1区瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的作用研究

材料与方法

参考文献

第四章 JZTX-V对大鼠脑中Kv4．2及KChIP2表达及内化迁移的作用研究

材料与方法

小结

本研究的创新性

参考文献

综述 蜘蛛毒素的生物学活性研究进展

个人简历

致谢