SQSTM1/p62增强食管鳞癌细胞凋亡抗性的作用机制研究

摘要

食管癌是消化系统的常见肿瘤，严重危害人类的身体健康。寻找其有效的基因靶点抑制肿瘤的生长并进行深入的功能研究，对于提高食管癌患者生存率和改善食管癌治疗具有重要的意义。实验室前期在研究食管癌抗凋亡基因PKCiota时发现，SQSTM1/p62表达受PKCiota影响，并且临床食管癌组织标本检测显示p62与PKCiota的蛋白表达正相关。p62是一个多功能的泛素化接头蛋白，在自噬调控、多条细胞信号通路以及肿瘤中发挥重要作用。目前p62在食管癌中的功能及作用机制均未有报道，为此我们对其进行了深入的研究。
　　我们首先利用免疫荧光细胞化学技术分析了食管癌细胞系KYSE150、KYSE180、KYSE510、KYSE450、Eca-109和COLO-680N中p62的表达水平及亚细胞定位情况，结果显示p62在COLO-680N细胞中表达较低，但在其它食管癌细胞系中均表达较高并定位于胞浆。随后我们选取KYSE450和KYSE180食管癌细胞系进行体外功能实验。采用敲降p62对细胞表型进行研究，发现在正常培养的条件下，改变p62蛋白表达不影响细胞增殖、凋亡、集落形成能力和细胞周期等表型;但经过无血清培养12h后，p62蛋白水平降低能明显促进食管癌细胞凋亡并抑制细胞集落形成能力。动物实验结果显示，p62蛋白表达降低可抑制裸鼠皮下瘤生长。
　　基于在无血清培养状态下，p62促进食管癌细胞抗凋亡能力和细胞生存活力，我们对p62影响其细胞表型相关的分子机制进行了探究。在无血清培养条件下敲降p62，Western blot检测发现S期激酶相关蛋白(SKP2)的蛋白水平下调，同时采用RT-PCR和Real-Time PCR检测发现SKP2的mRNA水平也降低。饥饿处理状态下敲降SKP2可增加食管癌细胞凋亡水平。进一步研究表明p62通过调节PKCiota蛋白表达而影响SKP2蛋白水平。利用免疫共沉淀(Co-IP)检测发现，p62与PKCiota相互结合。加入泛素化蛋白酶体抑制剂(MG132)作用24h后发现，在无血清培养条件下敲降p62组中SKP2蛋白水平有一定的回升，免疫沉淀(IP)实验检测发现与SKP2相连的多聚泛素化(Ub)蛋白水平明显增加。
　　随后我们构建了三个不同的p62结构域缺失突变体，检测对食管癌细胞表型的影响。结果显示p62的PB1结构域具有一定的生物活性，其缺失可明显降低食管癌细胞生存活力，同时在分子水平上证明p62结构中PB1结构域缺失可引起PKCiota蛋白水平的下调。
　　我们利用PKCiota抑制剂Aurothiomalate(ATM)处理食管癌细胞系，发现对细胞增殖和凋亡均没有明显的作用。但当p62-siRNA和ATM联合应用，发现可以明显促进食管癌细胞凋亡、抑制细胞生存活力和细胞增殖;同时在分子水平上分析发现，p62-siRNA和ATM联合处理组中p62、PKCiota和SKP2的蛋白水平均显著降低。
　　综上所述，p62通过PB1结构域与PKCiota相互作用，抑制SKP2蛋白泛素化降解，从而提高食管癌细胞抗凋亡能力和细胞生存活力。本研究的结果综合提示，p62有可能作为治疗食管癌的分子靶点。

目录

图表索引

中英文缩略词

摘要

前言

材料和方法

一．实验材料

二．实验方法

结果

一．SQSTM1／p62在食管癌组织中的表达

二．SQSTM1／p62对食管癌细胞生物学行为的影响

三．p62影响食管癌细胞凋亡的分子机制研究

四．探究p62调控SKP2蛋白水平的中间关键分子

五．探究p62与PKCiota相互作用的活性结构域

六．p62食管癌高表达对BALB／C裸鼠致瘤的影响

七．p62-siRNA和PKCiota抑制剂ATM联合应用对食管癌细胞靶向抑制研究

讨论

一．p62蛋白在肿瘤组织中表达上调

二．p62在食管癌细胞生物学作用及机制

三．p62影响食管癌抗凋亡的分子机制

四．p62-siRNA和PKCiota抑制剂ATM联合靶向抑制

结论

参考文献

文献综述 SQSTM1／p62参与肿瘤发生发展的研究进展

致谢

个人简历

课题资助

声明