腺苷1型受体在慢性心肾综合征水钠潴留中作用机制初探

摘要

背景:心肾综合征(Cardiorenal Syndrome，CRS)是同时累及心脏和肾脏的一大组疾病的统称，包括心脏（或肾脏）的急性或慢性功能不全导致肾脏（或心脏）的急性或慢性功能不全，或者共同因素同时导致心脏和肾脏的结构和功能损害。心功能和肾功能之间有着紧密联系，心肾同时受累，大大增加了疾病的诊治难度和死亡率1,2。根据2010年ADKI(Acute Dialysis Quality Initiative)共识，心肾综合征共分为5型3。CRS的病理生理机制尚未完全阐明，各型CRS在病生理机制上存在共同特征，可分为血流动力学机制与非血流动力学机制4。其中血流动力学机制的核心是水钠潴留和容量负荷增加，而非血流动力学机制包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）和交感神经系统激活、氧化应激、炎症反应等。
　　目前CRS动物模型多采用心肾手术构建、以急性变化为主，没有很好的模拟病理生理机制的慢性CRS动物模型，限制了对其病生理机制的探究。高醛固酮高盐饮食(DOCA-Salt)小鼠模型模拟了盐敏感高血压的病生理状态，前期我们观察到肾脏结构和功能的损害。本研究试图探索该模型是否同时存在心脏损害，从而为探究CRS机制提供平台。
　　腺苷1型受体（Adenosine A1 Receptor, A1AR）通过调节肾脏管球反馈、促进心脏释放心房利钠肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)调控水盐负荷;在非血流动力学机制方面，A1AR对RAAS起到直接抑制作用、对炎症和凋亡起到调节作用。但目前没有研究系统地探索在DOCA-Salt小鼠模型上A1AR对于心肾损害的意义。前期我们观察到A1AR主要通过血流动力学因素保护DOCA-Salt小鼠肾脏结构和功能，本研究试图通过血流动力学机制和非血流动力学机制两方面探索A1AR对DOCA-Salt小鼠心脏损害是否同样具有保护作用。
　　目的:
　　1.观察DOCA-Salt小鼠心脏损害，探索DOCA-Salt模型作为慢性CRS模型的可能性;
　　2.探索A1AR在DOCA-Salt小鼠水钠潴留中的作用;
　　3.探索A1AR在DOCA-Salt小鼠心肌肥大、心肌组织微血管密度、炎症和纤维化中的作用。
　　方法及结果:
　　1.DOCA-Salt小鼠心脏损害在C57BL/6J野生型小鼠上，行左肾切除术，术中于左肾窝埋置醋酸脱氧皮质酮(Deoxycorticosterone Acetate，DOCA)缓释药片，术后予高盐饮食，建立DOCA-Salt小鼠模型。采用尾套法测量血压、心率，观察到DOCA-Salt小鼠心率随实验周数显著下降（0周685.8±25.4 vs.8周526.6±103.9次/分，P＜0.01），平均动脉压显著上升（0周74.6±4.4 vs.8周88.5±6.5 mmHg，P＜0.01）。分别于第4周和第8周处死小鼠，并留取心脏标本，称量全心重量，观察到第8周时心脏重量指数显著增加（7.05±0.83 vs.5.16±0.20mg/g，P=0.007）。常规HE染色观察心肌组织镜下改变并测量左心室厚度无显著变化。Van Gieson胶原染色观察心肌组织纤维化程度，发现从第4周起出现局灶性间质纤维化;运用Realtime PCR方法分析转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)、胶原纤维1(Collagen1)在实验组和对照组间无差异。CD34免疫组化染色观察并分析心肌微血管密度，发现第4周时微血管密度显著增加（[1.01±0.003]％ vs.[0.59±0.001]％，P=0.030），第8周时微血管密度较对照组无显著变化。CD68免疫组化染色观察并分析巨噬细胞浸润程度，发现DOCA-Salt小鼠巨噬细胞浸润程度与对照组无差异;运用Realtime PCR方法分析趋化因子2(Chemokine C-Cmotif ligand2，CCL2)mRNA表达水平也无差异。
　　2.DOCA-Salt小鼠水盐负荷在第0、4、8周用代谢笼留24h尿，观察到DOCA-Salt小鼠24h尿量（0周1173±464 vs.4周3606±2359 vs.8周7635±3017μl，两两比较P＜0.05）及24h尿钠排出量（0周133.3±39.5 vs.4周798.4±719.4 vs.8周1788±854.0μmol/d，两两比较P＜0.05）随实验周数显著增加，尿渗透压（0周1801±642 vs.4周910±213mOsm/kg H2O,P＜0.05;0周1801±642 vs.8周860±233mOsm/kg H2O,P＜0.05)显著下降。Realtime PCR方法观察到心肌组织Corin和ANP mRNA表达在第4周显著增加，分别为31.9倍(P=0.005)和180.7倍（P=0.030），第8周时与对照组无差异。
　　Realtime PCR方法观察到DOCA-Salt小鼠心肌组织腺苷合成酶CD73 mRNA表达从第4周起显著上调（4周18.79倍，P=0.001;8周8.28倍，P=0.036），A1ARmRNA第8周开始出现显著上调（12.12倍，P=0.013），但Western Blot方法没有观察到A1AR蛋白表达水平的显著变化。
　　3.A1AR在DOCA-Salt小鼠心脏损害中的作用建立A1AR-/-DOCA-Salt小鼠模型，观察到A1AR-/-DOCA-Salt小鼠心率随实验周数下降（4周636±64.2 vs.0周696.7±35.2，P＜0.05），平均动脉压无显著变化。24h尿量相对于野生型实验组显著增加(7003±3742 vs.3606±2359μl，P＜0.05)，24h尿钠排出量较对照增加（1246.5±859.8 vs.146.6±71.2μmol/d, P＜0.05），尿渗透压较对照下降（702±165 vs.1394±397mOsm/kg，P＜0.05）。心肌组织ANPmRNA表达显著上调（12.65倍，P=0.026），Corin mRNA表达在实验组与对照组间无差异。
　　A1AR-/-DOCA-Salt小鼠第4周心脏重量指数及左心室厚度无显著变化;心肌组织微血管密度无显著升高;心肌巨噬细胞浸润程度、CCL2 mRNA表达水平在实验组与对照组间无差异;仅1只（共6只）小鼠心脏出现局灶性间质纤维化，TGF-β1和Collagen1 mRNA表达水平在实验组与对照组间无差异。
　　结论:本实验条件下
　　1.DOCA-Salt小鼠血压升高，心率下降，早期（4周）心脏微血管密度显著增加、出现局灶性间质纤维化，晚期（8周）心脏重量指数显著增加。结合前期研究观察到肾脏损害，DOCA-Salt小鼠存在心肾共同损害，可作为慢性CRS模型。
　　2.DOCA-Salt小鼠血压升高，提示存在水钠潴留，其水盐负荷受到相关因素调节:心脏CD73-A1AR和Corin-ANP通路激活，ANP限制水和钠的重吸收;24h尿量和24h尿钠排出量显著增加;前期研究观察到肾脏CD73-A1AR通路激活，提示管球反馈持续激活。A1AR-/-DOCA-Salt小鼠管球反馈丧失，24h尿量显著增加，血压较基线和对照组均无升高，提示A1AR加重水钠潴留。
　　3.A1AR-/-DOCA-Salt小鼠早期（4周）出现局灶性间质纤维化，心脏重量指数和微血管密度无显著变化。未观察到A1AR在DOCA-Salt小鼠模型中对心肌肥大、炎症和纤维化的明确保护作用。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 高醛固酮高盐饮食小鼠心脏损害

第二部分 盐高醛固酮高盐饮食小鼠水盐负荷

第三部分 腺苷1型受体在高醛固酮高盐饮食小鼠心脏损害中的作用

讨论

结论

参考文献

附录

综述 腺苷1型受体在心肾综合征中的作用

个人简历

致谢

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