长春花转录组与萜类吲哚生物碱代谢途径研究

摘要

长春花是抗肿瘤药物长春碱和长春新碱的唯一植物来源，也是研究萜类吲哚生物碱(TIA)生物合成与调控的模式物种。本研究分别利用Illumina二代测序技术和PacBio三代测序技术对长春花的叶、花和根的转录组进行了测序和分析。通过Illumina测序共得到140，787，121条短reads，经de novo拼接获得191，167条unigenes，平均长度674bp。基因注释发现了许多参与不同生物学过程和具有不同功能的基因，56.12％的基因在与7大数据库的比对中显示出同源性。GO分类鉴定出261个与次生代谢有关的基因，KOG分类鉴定出1809个与次生代谢合成、转运和分解有关的基因，KEGG注释鉴定出604个与萜类合成有关的基因及12个与吲哚生物碱合成有关的基因。差异表达分析结果显示，大多数TIAs途径相关基因在根和叶中的表达量较高，而文多灵途径的特有基因则在地上部分具有较高的表达量。因此，根据与已知基因的共表达原理，筛选出可能参与TIAs生物合成的8个P450候选基因和5个功能基因。三代测序共获得786，008条长reads，其中花264，553条、根262，140条、叶259，315条。经数据处理，得到全长转录本（full-length reads）378，581条（花:123，665条、根:120，510条、叶:134，406条），非全长转录本（non-full-length reads）311，081条（花:105，613条、根:106，459条、叶:99，009条）。通过比对全长转录本序列，分析转录因子及已知的长春花TIAs途径催化酶编码基因，发现了一些可能的可变剪切形式，提示可变剪切可能参与TIAs生物合成途径的调控。采用不同平台进行的大规模转录组测序为研究长春花特殊的次生代谢产物合成途径提供了丰富的数据资源，PacBio三代测序技术在读长上的优势也使得分析可变剪切及探究可变剪切对TIAs途径相关基因表达调控的影响成为了可能。
　　本研究还初步探索了通过在酿酒母中重构TIAs合成途径生产TIAs的可行性。首先通过转录组数据分析发现酿酒酵母稀有密码子在长春花基因中的使用频率偏低，推测长春花基因适合在酿酒酵母中进行表达。克隆了10个已知的环烯醚萜途径催化酶基因，经序列比对发现，除CPR、DLGT、IRS和LAMT存在个别碱基的差异外，其余序列均与GenBank序列完全一致。采用SOE-PCR法构建催化环烯醚萜途径前两步反应的GES、G10H和CPR表达模块，通过酵母体内重组方法构建三元表达载体，建立从元件选择、模块构建到多模块体内重组的技术流程，为实现完整TIAs合成途径在酵母中的重建奠定技术基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 转录组测序技术及研究进展

1．1．1 测序技术的历史与发展

1．1．2 高通量转录组测序研究进展

1．2 长春花转录组与萜类吲哚生物碱代谢途径研究进展

1．2．1 长春花转录组研究进展

1．2．2 长春花萜类吲哚生物碱代谢途径的解析

1．2．3 长春花萜类吲哚生物碱代谢途径的调控

1．3 合成生物学与天然产物的异源合成

1．3．1 合成生物学的概念与研究思路

1．3．2 合成生物学在天然产物异源合成研究中的应用

第二章 研究材料与方法

2．1 材料、试剂与设备

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 主要设备

2．2 方法

2．2．1 PacBio三代转录组测序

2．2．2 Illumina二代转录组测序

2．2．3 代谢途径关键酶基因的克隆与载体构建

第三章 结果与讨论

3．1 基于Illumina二代测序平台的长春花转录组分析

3．1．1 测序数据的质量评估与预处理

3．1．2 转录本拼接

3．1．3 基因功能注释

3．1．4 SSR分析

3．1．5 差异表达分析

3．1．6 TIAs途径基因表达差异分析及基因挖掘

3．2 基于PacBio三代测序平台的可变剪切分析

3．2．1 PacBio三代测序与全长转录本

3．2．2 TIAs合成途径相关转录因子及催化酶编码基因的可变剪切

3．3 基于转录组数据的密码子使用偏好性分析

3．3．1 通过转录组数据进行密码子使用偏好性分析的可行性

3．3．2 基于转录组的长春花密码子偏好性分析

3．4 环烯醚萜的途径关键酶基因的克隆与载体构建

3．4．1 环烯醚萜途径关键酶基因的克隆

3．4．2 SOE-PCR法构建表达模块

第四章 结论

参考文献

缩略词

附录

致谢

作者简历