基于高通量测序技术的恶性疟原虫Plasmodium falciparum3D7虫株红内期新的长链非编码RNA的分析与初步验证

摘要

疟疾是由疟原虫引起的一种严重的寄生虫病。其中，恶性疟原虫是导致人类疟疾感染致死率最高的病原体。
　　恶性疟原虫的生活史包括在人体内的无性繁殖阶段（红外期和红内期）以及在蚊体内的有性繁殖期（蚊期）。恶性疟原虫在红细胞内期的裂体增殖是疟疾发作的基础，包括从裂殖子侵入红细胞开始的裂殖子期、环状体期、早期和晚期滋养体期直至裂殖体期。研究恶性疟原虫在红细胞内的生长发育过程具有非常重要的意义。
　　长链非编码RNA是一类长度大于200核苷酸并且不具有蛋白编码能力的转录本，占全部非编码RNA的近80％。研究表明，lncRNA可通过繁复的机制参与有机体的各种活动，如表观遗传学修饰、转录和翻译调控以及剪切拼接控制细胞周期、细胞分化和细胞凋亡等。恶性疟原虫基因组转录大量的lncRNA，但这些lncRNA在恶性疟原虫的增殖发育过程中的作用却知之甚少。
　　为了探索恶性疟原虫红内期不同发育阶段的lncRNA表达谱及其特异性。本研究采用山梨醇连续多次处理体外培养并处于环状体的恶性疟原虫虫株，获得高度同步化、窗口小、虫血率高并处于不同生长阶段的恶性疟原虫虫株，选取环期以及裂殖体期构建了2个时期的链特异性文库，并进行Illumina/Solexa双末端测序。通过进一步对环期与裂殖体期的测序数据进行生物信息学分析，序列比对、序列拼接、编码潜能分析预测了55条在红内期特异性表达的lncRNA。其中13条lncRNA通过RT-PCR得到验证，为后期进一步研究恶性疟原虫红内期期特异性表达的lncRNAs的功能提供了基本的数据信息。

目录

摘要

1 前言

1．1 疟疾和疟原虫简介

1．2 恶性疟原虫体外同步化培养

1．3 长链非编码RNA概述

1．4 恶性疟原虫lncRNA研究进展

2 研究策略和技术路线

3 实验方法

3．1 P．falciparum 3D7体外培养

3．2 5％D-山梨醇同步化体外培养P．falciparum 3D7虫株

3．3 红细胞裂解、P．falciparum 3D7虫体收集和RNA提取

3．4 DNase消化去除RNA样品残留的DNA

3．5 RNA样品凝胶电泳检测

3．6 生物信息学分析由诺和致源公司完成

3．7 逆转录PCR验证lncRNA

4 实验结果

4．1 红内期P．falciparum 3D7虫株体外培养同步化结果

4．2 P．falciparum3D7 RNA的提取与质量检测

4．3 llumina／Solexa双末端测序结果分析

4．4 lncRNAs RT-PCR验证

5 讨论

5．1 恶性疟原虫同步化方法

5．2 高通量测序与生物信息学结合预测新的lncRNAs

5．3 P．falciparum 3D7的lncRNAs特点与期特异性表达

5．4 P．falciparum 3D7的lncRNAs验证

5．5 本研究存在不足与展望

结论

参考文献

附录

硕士期间发表的文章和参加的会议

致谢

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