冠心病患者血浆高密度脂蛋白组分功能与机体炎症状态的相关性研究

摘要

第一部分:冠心病患者血浆高密度脂蛋白组分与血浆炎症相关指标的相关性研究研究背景:
　　炎症是促进冠心病(coronary artery disease，CAD)发生、发展的重要因素。已有研究表明血浆炎症指标与CAD的关系密切，尤其是在急性冠脉病变患者中，血浆中某些急性时相反应蛋白和炎症因子的水平升高意味着预后不良。然而，这些炎症相关指标与稳定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD)之间的关联研究甚少。而炎症促进CAD的具体机制尚不明确。血浆高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）可通过促进组织细胞内的胆固醇外流、抗炎症及抗氧化反应，以及直接的内皮保护功能抑制动脉粥样硬化。血浆高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平过低是心血管疾病发生的独立危险因素。然而，最近发现高血浆HDL-C水平者仍然存在发生急性心肌梗死的风险，CAD患者血浆HDL-C水平预测心脏事件的能力下降，有可能与CAD患者血浆HDL的保护功能减弱或丧失有关。越来越多的研究证实炎症是引起血浆HDL功能及组分改变的重要因素之一，而CAD患者体内长期存在的慢性炎症有可能通过干扰HDL代谢引起HDL-C水平及HDL组分的改变，进而影响了HDL正常生理功能的发挥。血清淀粉样蛋白（serum amyloid A，SAA）是一种由肝脏合成的急性时相反应蛋白，炎症反应时，血浆SAA水平升高，且可掺入HDL颗粒中，影响HDL的功能。本课题组的前期研究已发现，CAD患者血浆HDL中的SAA水平升高。因此，为了进一步研究CAD患者体内炎症状态与HDL组分中SAA（HDL-associated SAA）水平的关系以及炎症相关指标在CAD诊断中是否具有价值，本研究拟从以下研究目的入手，进行研究。
　　研究目的:
　　1.比较稳定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD)患者、急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)患者与非CAD对照者之间血浆炎症相关指标[急性时相反应蛋白hsCRP（高敏C反应蛋白）、AAT（α1-抗胰蛋白酶）和SAA/炎症因子IL-6（白细胞介素-6）和MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）]水平的差异。
　　2.评价单独或联合检测上述血浆炎症相关指标在CAD诊断中的价值。
　　3.分析比较CAD患者（包括sCAD及ACS患者）血浆HDL-C水平、HDL-associatedSAA水平与上述血浆急性时相反应蛋白/炎症因子水平之间的相关性。
　　研究方法:
　　1.临床病例收集:本研究共纳入经冠状动脉造影确诊的CAD患者116例及性别、年龄相匹配的非CAD对照患者65例。根据患者胸痛发作的特点及心肌酶学等检查结果，将CAD组进一步分为稳定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD，n=42)及急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS，n=74)两亚组。
　　2.实验室指标检测:所有研究对象采集空腹静脉血，超速密度梯度离心法分离提取血浆HDL。采用BCA法检测血浆HDL样品中的蛋白含量，免疫印迹法鉴定HDL样品中载脂蛋白A-Ⅰ的富集。应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)技术检测血浆α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)水平、血浆SAA水平以及HDL组分相关的SAA水平。液相芯片技术检测血浆白细胞介素-6（interleukine-6，IL-6）及单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotactic protein1，MCP-1)的水平。
　　3.数据分析:统计学方法比较各组间上述急性时相反应蛋白/炎症因子血浆水平的差异。Logistic回归分析上述炎症指标与CAD发病之间的关系。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评价上述指标单独或联合检测在诊断CAD方面的价值。非参数Z检验比较不同指标在CAD诊断中的价值差异。Pearson或Sperman相关性分析评价血浆HDL-C水平、HDL-associated SAA水平与上述急性时相反应蛋白/炎症因子血浆水平的相关性。
　　研究结果:
　　1.与非CAD对照组相比较，ACS患者血浆hsCRP、AAT、SAA、IL-6以及MCP-1的水平均明显升高[hsCRP:2.59(1.07-5.31) mg/L vs.1.21（0.70-2.07）mg/L，P＜0.001; AAT:151.55±22.17 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl,P=0.005; SAA:9.54(2.92-24.50)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml, P＜0.001; IL-6:2.37(1.57-6.30) pg/ml vs.1.77(1.175-2.62) pg/ml, P＜0.001;MCP-1:305.26(244.96-373.29) pg/ml vs.281.29(225.74-344.01) pg/ml,P=0.013]。而在sCAD患者中，除血浆MCP-1水平外[264.15(215.35-391.30) pg/ml vs.281.29(225.74-344.01) pg/ml，P=0.213]，hsCRP、AAT、SAA及IL-6的血浆水平均高于非CAD对照组[hsCRP:2.20(1.27-3.45)mg/L vs.1.21(0.70-2.07)mg/L，P=0.001;AAT:148.90±26.36 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl,P=0.047;SAA:7.04(4.26-15.63)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml,P=0.004; IL-6:2.46(1.66-4.01)pg/ml vs.1.77(1.175-2.62) pg/ml，P=0.026]。上述各炎症指标在ACS患者与sCAD患者之间的差异均未达到统计学意义（P均＞0.05）。
　　2.多因素Logistic回归分析显示:在校正了其他传统的心血管危险因素后，血浆IL-6水平与SAA水平仍与CAD相关(IL-6:0R=5.384，95％CI:1.194-24.283，P=0.029; SAA:0R=5.205,95％CI:1.326-20.423,P=0.018)。
　　3.CAD患者血浆hsCRP、SAA以及IL-6水平与冠状动脉狭窄程度相关(hsCRP:r=0.274,P=0.004;SAA: r=0.215,P=0.025; IL-6: r=0.210,P=0.027)。
　　4.联合上述指标可提高CAD的诊断价值，ROC曲线下面积AUC=0.849，95％CI:0.776-0.906，显著高于各指标单独检测（P均＜0.05），敏感度为63.3％，特异度为88.2％。
　　5.相关性分析显示:血浆HDL-C水平与hsCRP水平的相关性仅存在于总研究人群中（r=-0.192，P=0.011）。CAD患者中血浆HDL-C与hsCRP水平之间无显著相关性（r=-0.132，P=0.165），而HDL-associated SAA水平则与上述各炎症指标均具有显著的相关性（hsCRP: r=0.584，P＜0.001; AAT:r=0.221，P＜0.001:SAA:r=0.740,P＜0.001; IL-6:r=0.412,P＜0.001; MCP-1: r=-0.242,P=0.009）。
　　研究结论:
　　1.CAD患者体内存在慢性炎症反应。无论sCAD或ACS患者血浆炎症相关指标（hsCRP、AAT、SAA、IL-6和MCP-1）水平均显著升高。
　　2.高血浆IL-6和SAA水平可能增加冠心病的发生风险。
　　3.应用上述炎症相关指标联合检测可提高CAD的诊断能力。
　　4.血浆炎症指标与HDL-associated SAA水平具有相关性，而HDL-C仅与hsCRP水平呈弱的负相关性。提示:HDL组分相关蛋白可能是与疾病状态关系更为密切的指标，可能成为CAD的诊治靶点。
　　第二部分:冠心病患者血浆HDL促进血管内皮细胞炎症激活的机制研究研究背景:
　　一直以来，血浆高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)被认为具有心血管保护功能。健康人血浆HDL能够显著抑制多种致动脉粥样硬化性物质所引起的血管内皮损伤。HDL生理功能的发挥依赖于其组成成分及含量的正常。然而，最近证实:在某些疾病时，血浆HDL存在不同程度的功能障碍。其中，炎症反应可能是导致HDL组分及其功能改变的重要因素之一。冠心病(coronary artery disease,CAD)是一种血管壁的慢性炎症性疾病，已有研究报道CAD患者血浆HDL的内皮保护功能受损，但具体机制尚不清楚，推测CAD患者体内长期存在的慢性炎症反应促使血浆HDL组分改变可能是部分原因。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）是肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，本课题组前期工作及国内外其他研究小组均已证实CAD患者血浆HDL组分中SAA的含量显著增加。富集了SAA的血浆HDL其抗炎能力减弱，但具体机制尚不清楚。血管内皮细胞作为局部炎症反应的主动参与者，CAD患者的血浆HDL有可能促进其炎症激活。因此，本部分研究拟从CAD患者的HDL是否能够刺激血管内皮细胞产生炎症因子入手，探讨其对血管内皮细胞炎症发生的机制。
　　研究目的:
　　1.观察比较CAD患者与非CAD对照组血浆HDL对血管内皮细胞炎症激活的影响。
　　2.研究CAD患者血浆HDL对血管内皮细胞炎症激活的信号通路。
　　3.探索SAA富集在CAD患者血浆HDL促炎性功能转变中的作用。研究方法:
　　本研究纳入经冠状动脉造影确诊的CAD患者12例，以及性别、年龄相匹配的非CAD对照者10例。所有研究对象留取空腹静脉血，应用密度梯度超速离心法分离提取血浆HDL，即为HDLCAD和HDLcontrol。将对照组血浆与重组人SAA于体外条件下共同孵育，分离提取血浆HDL，即为富含SAA的HDL（HDL-bound-SAA）。分别以浓度为100μg/ml的HDLCAD、HDLcontrol与HDL-bound-SAA处理体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，观察不同干预对内皮细胞炎症激活状态的影响。以下述指标判断内皮细胞的炎症激活状态:(1)激光扫描共聚焦显微镜观察核转录因子(NF-κB) p65亚基的入核情况;(2)Realtime-PCR及ELISA方法检测白细胞介素-6（interleukine-6，IL-6）及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表达与分泌情况;(3) Realtime-PCR及Western blot法检测细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及Toll样受体2（Toll-like receptor2，TLR2）的表达。为探索HDLCAD刺激内皮细胞引发炎症的可能机制，分别以TLR2中和抗体阻断内皮细胞TLR2介导的信号通路，以p38MAPK信号转导通路特异性抑制剂SB203580阻断该通路的作用，确定富含SAA的HDLCAD诱导内皮细胞炎症发生的信号通路。
　　研究结果:
　　1.与HDLcontrol不同，HDLCAD本身可刺激内皮细胞NF-κBp65亚基向细胞核转位，显著上调内皮细胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表达。
　　2.TLR2中和抗体与p38MAPK信号转导通路特异性抑制剂SB203580均可显著抑制HDLCAD所诱导的内皮细胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表达，说明HDLCAD刺激内皮细胞炎症指标升高是通过TLR2及p38MAPK信号通路激活的。
　　3.与HDLcontrol相比，HDL-bound-SAA可以刺激内皮细胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表达，与HDLCAD对内皮细胞的作用一致。
　　研究结论:
　　在无其他外源性刺激时，CAD患者血浆HDL本身即可激活内皮细胞炎症状态，且该作用是通过TLR2受体与p38MAPK信号通路发挥的。患者血浆中SAA水平的升高可促使HDL组分中SAA含量增加。而SAA在HDL组分中的富集部分参与了CAD患者血浆HDL功能的促炎性改变。

目录

英文缩略词表

主要实验仪器

摘要

前言

第一部分：冠心病患者血浆高密度脂蛋白组分与血浆相关指标的相关性研究

一、研究背景

二、研究目的

三、研究对象及方法

四、研究结果

五、研究小结

六、讨论

第二部分：冠心病患者血浆HDL促进血管内皮细胞炎症及其分子机制

一、研究背景

二、研究目的

三、研究对象及方法

四、研究结果

五、研究小结

六、讨论

结论

参考文献

论文综述

个人简历

致谢

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