胆碱能受体途径在HaCaT细胞粘附及天疱疮发病中的作用及机制研究

摘要

天疱疮是一种以血清中存在抗表皮蛋白抗体为特征的自身免疫性皮肤病，桥粒芯蛋白抗体在本病的发生中具有重要作用。近年的研究发现，除了桥粒芯蛋白途径之外，还有其它因素在该病发生中发挥一定作用，其中胆碱能受体与天疱疮关系较为密切。
　　本研究将以胆碱能受体为研究对象，利用HaCaT细胞构建天疱疮细胞模型，研究胆碱能受体途径在细胞粘附和天疱疮发病中的作用，从而进一步完善天疱疮的发病机制理论。
　　第1部分胆碱能途径药物对HaCaT细胞粘附功能的影响及机制研究
　　目的:研究胆碱能途径药物对HaCaT细胞粘附功能的影响及其机制。
　　方法:培养HaCaT细胞至融合状态后，分别加入适当浓度的胆碱能途径药物，通过细胞解离实验检测细胞粘附的变化情况，结果以细胞碎片数表示;分别用RIPA和TritonⅩ-100裂解细胞，得到总蛋白和胞浆蛋白，用Western Blot测定细胞表面与粘附相关的蛋白Dsg1、Dsg3、PG、E-钙粘素的变化;用qPCR检测上述细胞表面蛋白在mRNA水平的变化。
　　结果:对照组、阿托品、筒箭毒碱、卡巴胆碱作用后细胞碎片数目分别为6.33±1.15、35.00±2.65、6.33±1.53、6.00±1.00;阿托品在蛋白质和mRNA水平减少Dsg3表达，并使Dsg3从胞膜脱离，卡巴胆碱可增加Dsg1、Dsg3、PG表达，并促使Dsg1、PG粘附于胞膜。筒箭毒碱对各种细胞表面蛋白均无明显影响。
　　结论:胆碱能途径药物可以调节细胞间粘附分子，尤其是桥粒分子的表达，并影响这些分子在细胞膜上的稳定性，从而介导细胞间粘附。
　　第2部分利用HaCaT细胞构建天疱疮细胞模型
　　目的:利用HaCaT细胞与PV-IgG共培养构建天疱疮细胞模型。
　　方法:收集典型寻常型天疱疮患者，从血清中纯化IgG，以1mg/ml的浓度与HaCaT细胞共培养，通过细胞解离实验观察PV-IgG对HaCaT细胞粘附功能的影响;通过免疫荧光观察桥粒蛋白的染色模式;通过Western Blot观察桥粒分子蛋白质水平的变化;通过qPCR观察桥粒分子mRNA水平的变化;通过免疫共沉淀研究Dsg3与PG的相互作用情况;通过磷酸化测定观察p38 MAPK、EGFR磷酸化水平。
　　结果: PV-IgG与HaCaT细胞共培养后，可以使HaCaT细胞碎片数目增多，桥粒分子内化降解，桥粒稳定性下降，Dsg3与PG相互作用减弱，但对桥粒分子mRNA水平的表达没有影响;也可出现p38MAPK与EGFR的磷酸化，且p38 MAPK的磷酸化发生于EGFR磷酸化之前。
　　结论:利用HaCaT细胞和PV-IgG可以构建天疱疮的细胞模型，桥粒分子出现了与体内棘层松解过程一致的变化。
　　第3部分胆碱能受体激动剂卡巴胆碱缓解天疱疮棘层松解的机制研究
　　目的:研究胆碱能受体激动剂对天疱疮棘层松解的缓解作用及其机制。 方法:将HaCaT细胞与PV-IgG和胆碱能受体激动剂卡巴胆碱共培养，以PV-IgG诱导的天疱疮细胞模型作为对照，通过细胞解离实验定量分析卡巴胆碱对棘层松解的缓解情况，用免疫荧光方法定性观察桥粒蛋白变化;分别用RIPA和TritonⅩ-100裂解细胞，得到总蛋白和胞浆蛋白，用Western Blot观察细胞表面与粘附相关的Dsg3、PG的变化，以及不同时间点p38 MAPK、EGFR的磷酸化水平;用qPCR检测上述细胞表面蛋白在mRNA水平的变化;通过免疫共沉淀方法定性分析Dsg3与PG相互作用的变化情况。
　　结果:在HaCaT细胞与PV-IgG、卡巴胆碱共培养，发现与PV-IgG组相比细胞碎片数明显减少（18.67±2.52 vs46.67±2.03，t=11.22，p＜0.01）;免疫荧光实验发现卡巴胆碱可以缓解PV-IgG所致的桥粒分子内化。在天疱疮细胞模型中，细胞总的Dsg3和PG含量下降，非桥粒部分的Dsg3下降，非桥粒PG含量增加，且Dsg3与PG的相互作用减弱，加入卡巴胆碱后可缓解上述变化。卡巴胆碱也可使Dsg3 mRNA的相对表达量由1.428±0.215增加至4.974±0.948（t=3.65，p=0.01），PG mRNA的相对表达量由1.563±0.247增加至13.420±1.715（t=6.85，p＜0.01）。磷酸化实验中，卡巴胆碱可以抑制EGFR磷酸化，而对p38 MAPK磷酸化无明显影响。
　　结论:胆碱能受体激动剂卡巴胆碱具有缓解棘层松解的作用，这种缓解作用的机制可能包括:抑制Dsg3和PG内化并增加其表达，增强Dsg3与PG的相互作用，抑制棘层松解关键信号EGFR的磷酸化。
　　第4部分干扰m3、α9 AChR对HaCaT细胞粘附功能的影响
　　目的:研究m3、α9 AChR干扰后HaCaT细胞粘附功能和桥粒分子的变化情况。
　　方法:利用RNA干扰技术分别干扰m3、α9 AChR的表达，检测干扰效率及最佳的干扰时间;利用细胞解离实验观察m3或α9 AChR表达抑制后HaCaT粘附功能的变化情况;利用Western Blot观察m3或α9 AChR表达抑制后骨架相关和非骨架相关桥粒连接蛋白的变化;利用qPCR观察桥粒蛋白mRNA水平的变化。
　　结果:在HaCaT细胞中加入m3或α9 AChR干扰序列后，在48h对相应基因的表达均有较好的抑制效果;m3 AChR表达抑制后细胞粘附力下降而α9 AChR的低表达对细胞粘附功能没有明显影响;m3 AChR表达抑制后使桥粒稳定性下降，α9 AChR表达抑制使桥粒稳定性提高;m3 AChR表达抑制后，Dsg1 mRNA表达水平下降、PG表达增多，α9 AChR表达抑制后，Dsg1、PG mRNA的表达增多，Dsg3表达下降。
　　结论:干扰m3 AChR的表达后HaCaT细胞的粘附力下降，桥粒稳定性下降;干扰α9 AChR并不影响细胞粘附功能，但可使桥粒稳定性上升。
　　第5部分干扰m3、α9 AChR对天疱疮细胞模型棘层松解的影响
　　目的:探索m3或α9 AChR低表达时HaCaT细胞在PV-IgG作用下棘层松解的变化情况。
　　方法:通过RNA干扰技术抑制HaCaT细胞m3或α9 AChR的表达，在此基础上与PV-IgG共培养，通过细胞解离实验观察细胞粘附功能的变化;通过免疫荧光观察桥粒分子染色模式的变化;利用Western Blot观察m3或α9 AChR表达抑制后骨架相关和非骨架相关桥粒连接蛋白的变化;通过免疫共沉淀研究Dsg3与PG的相互作用情况;通过磷酸化测定观察p38 MAPK、EGFR磷酸化水平。
　　结果:在m3 AChR干扰时，HaCaT在PV-IgG作用下更容易发生棘层松解，骨架相关的Dsg3和PG明显下降，且EGFR的活化程度增强，而α9 AChR干扰对棘层松解有保护作用，在PV-IgG作用下，桥粒分子不发生内化，骨架相关Dsg3和PG不减少，Dsg3与PG的相互作用更紧密，p38 MAPK和EGFR均不发生磷酸化。
　　结论: m3和α9AChR在天疱疮的发病中发挥一定作用，且二者在棘层松解某些环节上的作用是相反的。

目录

缩略语

摘要

前言

参考文献

第1部分 胆碱能途径药物对HaCaT细胞粘附功能的影响及机制研究

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 参考文献

第2部分 利用HaCaT细胞构建天疱疮细胞模型

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 参考文献

第3部分 胆碱能受体激动剂卡巴胆碱缓解天疱疮棘层松解的机制研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 参考文献

第4部分 干扰m3、α9AChR对HaCaT细胞粘附功能的影响

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 参考文献

第5部分 干扰m3、α9 AChR对天疱疮细胞模型棘层松解的影响

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 参考文献

全文小结

附录

致谢

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