USP18/SOCS1在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干扰素中的作用及其分子机制研究

摘要

背景:
　　全球约1.5亿人感染HCV，并且部分患者会发展成慢性感染进而引发肝硬化及肝癌等疾病，严重危害人类健康。目前，长效干扰素联合利巴韦林是治疗慢性丙型肝炎的标准治疗方案。但是，由于IFN-α受体在体内广泛分布而引发一系列不良反应，加之耐药性的存在，严重阻碍了它的临床应用。新的IFN家族——Ⅲ型干扰素(IFN-λ)，具有有限的受体分布且相同的抗病毒作用，成为替代IFN-α用于临床治疗HCV慢性感染者的新希望。
　　干扰素刺激基因是IFN信号传导通路中发挥抗病毒作用的终极武器，但是同时也是一把双刃剑。ISG中存在一类负调控因子（包括USP18和SOCS1），他们阻断干扰素信号通路的传导形成负反馈调节，这也是造成HCV对IFN治疗耐受的原因之一。USP18(Ubiquitin specific protease18)是一种泛素特异性蛋白，它可以通过与IFNAR2受体结合阻断Ⅰ型干扰素信号通路的传导，而对于Ⅲ型干扰素信号通路的影响还是个未知数。同时，细胞因子信号传导抑制分子1(Suppressor of cytokinesignaling1，SOCS1)作为干扰素内源性抑制物，可以与Tyk2相互作用从而阻断干扰素信号通路，抑制干扰素抗病毒活性导致HCV持续感染。而SOCS1在HCV的入胞和分泌过程中的作用还鲜有报道。
　　多项研究表明（包括本课题组前期研究），肝组织内ISG差异表达与治疗疗效密切相关。此外，外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）有可能替代肝穿样本用于疗效预测的检测。考虑到目前干扰素治疗HCV感染疗效不理想及广泛的不良反应，揭示HCV耐药的分子机制和建立高效的疗效预测手段是HCV科研领域两个亟待解决的关键问题。本研究立足于探讨负调控因子(USP18和SOCS1)在HCV耐受干扰素中的作用机制。
　　目的:
　　1、研究IFN-α和IFN-λ激活Jak/STAT及ISG表达的时间效应曲线的差异;
　　2、验证高表达USP18/SOCS1对IFN-α和IFN-λ信号传导通路的调控和抗HCV活性的影响及在HCV病毒生活史中的作用（入胞、复制和分泌）;
　　3、探讨慢性丙肝病人PBMC中相关基因的表达水平差异与治疗疗效的相关性。
　　方法:
　　1、将pCR3.1/SOCS1和pCR3.1/USP18真核表达质粒转染入Huh7.5.1细胞中，通过Realtime PCR和Western blot检测目标基因的表达情况从而优化最适表达质粒转染剂量，转染试剂使用量及IFN浓度。给予IFN-α和IFN-λ刺激后，不同时间点取样，Realtime PCR测定ISG时间效应曲线以及高表达USP18/SOCS1对于时间效应曲线的影响。
　　2、将pCR3.1/USP18和pCR3.1/SOCS1表达质粒转染入复制子细胞Con1b、JFH1-2a及HCVcc体外培养系统中，通过双荧光报告基因系统、Realtime PCR和Western blot检测高表达USP18/SOCS1对IFN信号通路中P-STAT1磷酸化水平、ISRE活性及ISG表达水平的影响及HCV RNA复制水平的影响。在HCVcc体外培养系统中高表达USP18/SOCS1，收集上清液，通过测定TCID50明确高表达USP18或SOCS1对HCV分泌的影响;提取胞内RNA，逆转录后通过Realtime PCR检测USP18或SOCS1高表达对HCV受体的调控及HCV RNA复制水平的影响从而确定其对HCV入胞的影响。
　　3、从48个治疗后的HCV慢性患者中提取PBMC，体外培养8h并同时给予IFN-α刺激，将未经IFN-α刺激的体外培养PBMC作为阴性对照，通过Realtime PCR检测相关基因的转录水平变化并确定其与治疗疗效的相关性。
　　结果:
　　1、使用最适转染体系及最佳IFN工作浓度，我们确认两种干扰素(IFN-α/IFN-λ)诱导ISGs(ISG15/MxA)的时间效应曲线具有明显差异:IFN-α诱导下ISG表达的时间效应曲线峰值出现快且持续时间短，而IFN-λ诱导下ISG表达的时间效应曲线峰值出现慢且持续时间长;而由这两种干扰素诱导产生的负调控因子(USP18/SOCS1)表达的时间效应曲线正好与之相反。提示干扰素信号传导通路中两个主要的负调控因子SOCS1及USP18是导致Ⅰ型和Ⅲ型干扰素激活Jak/STAT刺激ISG表达的时间动力学差异的主要原因。
　　2、高表达USP18/SOCS1在HCV复制子细胞(Con1b和JFH1-2a)中，可以通过下调P-STAT磷酸化水平、减弱ISRE活性及降低ISG表达水平从而全面阻断Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素信号通路。此外，在HCVcc体外培养系统中也表明，由它们所介导的这种对干扰素信号传导通路的抑制作用显著地促进了HCV的复制水平，并且高表达USP18显著上调了HCV受体LDLR和SR-BI的转录水平从而促进了HCV病毒的入胞，而高表达SOCS1虽然显著上调了HCV受体LDLR的转录水平但对 HCV病毒的入胞无影响。此外这两种负调控因子对于HCV分泌均无影响。
　　3、本实验对PBMC中部分基因的表达变化与干扰素治疗HCV疗效相关性进行了初步探讨，我们明确了MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在干扰素治疗无应答组的本底水平高表达，而USP18和ISG15在治疗有应答与无应答不同组中本底水平的表达无差异。
　　结论:
　　1、证明负调控因子(USP18/SOCS1)的表达差异是造成IFN-α和IFN-λ激活干扰素信号传导通路诱导抗病毒ISG(ISG15/MxA)时间效应曲线差异的主要原因，可能也是造成IFN耐受的原因之一。
　　2、高表达USP18/SOCS1可以阻断Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素信号通路而显著促进HCV病毒复制，其中，高表达USP18可以上调HCV入胞受体水平而有利于病毒入胞。促进HCV入胞、刺激HCV RNA复制及全面抑制干扰素信号传导通路也许是HCV耐受干扰素导致治疗失败的重要原因。
　　3、明确HCV慢性患者PBMC中MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在本底水平的高表达与干扰素治疗无应答密切相关，有望发展成为一种简易的疗效预测手段用于病毒性肝炎个体化治疗及精准医学研究。

目录

摘要

前言

丙型肝炎病毒

干扰素IFN

研究目的与意义

1 本研究的目的

2 本研究的意义

3 本研究的技术路线

第一部分 Ⅰ型干扰素(IFN-α)和Ⅲ型干扰素(IFN-λ)激活干扰素信号传导通路及ISG表达的时间效应曲线的差异性及高表达质粒转染条件的优化

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

研究结果

1 高表达质粒转染体系的优化

2 IFN-α和IFN-λ激活Jak／STAT及ISG表达的时间效应曲线

讨论

第二部分 高表达USP18／SOCS1阻断Ⅰ型干扰素(IFN-α)和Ⅲ型干扰素(IFN-λ)信号传导通路从而促进HCV病毒的复制

材料与方法

1．实验材料

2 实验方法

实验结果

1 USP18／SOCS1在HCV复制子细胞(Con1b和JFH1-2a)中抑制I型干扰素(IFN-α)和Ⅲ型干扰素(IFN-λ)信号传导通路

2 USP18／SOCS1对于HCV复制水平的影响

3 USP18／SOCS1对于HCV入胞的影响

4 USP18／SOCS1对于HCV分泌的影响

讨论

第三部分 慢性丙肝病人PBMC中相关基因的表达水平与治疗疗效的相关性研究

材料与方法

1．实验材料

2 实验方法

实验结果

1 一般材料

2 不同组别PBMC中典型抗病毒蛋白ISG15，MxA水平

3 不同组别PBMC中负调控因子USP18，SOCS1水平

4 不同组别PBMC中IFN受体水平IFNAR1，IFNλR表达水平

讨论

参考文献

文献综述 IFNλ：一类独特的干扰素对HCV病毒的研究进展

附录

个人简历

在学期间发表的学术论文

在学期间申报获批的课题

在学期间参加学术交流情况

致谢

声明