C-Myc/SLC1A5信号通路介导的谷氨酰胺代谢重编程对鼻咽癌生长及放射敏感性的影响

摘要

以葡萄糖无氧酵解为主的供能模式一直被认为是人类肿瘤细胞的重要生物学特征之一。近年来有研究发现，谷氨酰胺也是多种肿瘤细胞赖以生存的重要营养物质。既往乳腺癌、卵巢癌的体外及在体研究表明，在细胞内外因素驱动下，肿瘤细胞发生谷氨酰胺代谢重编程，可从细胞外摄取谷氨酰胺，为鸟苷酸循环和后续的生物大分子的合成提供碳源、维持氧化还原平衡、调控生长增殖相关信号通路，从而促进肿瘤的发生发展。此外，谷氨酰胺代谢的改变与乳腺癌的恶性程度、复发存在一定的相关性。但是，谷氨酰胺的代谢和鼻咽癌发展之间的关系尚未见报道。本研究拟从以下三个方面探究谷氨酰胺代谢和鼻咽癌的关系:1.观察外源性谷氨酰胺对人鼻咽癌细胞生长增殖、凋亡等生物学特性及放疗敏感性的影响;2.观察谷氨酰胺代谢相关基因表达对鼻咽癌生长的调控作用，筛选新的增强放射敏感性的靶点;3.探讨鼻咽癌细胞谷氨酰胺成瘾的潜在分子机制。
　　有研究报道称，c-Myc基因过表达的多种肿瘤细胞具有谷氨酰胺成瘾性;本研究前期蛋白免疫印迹实验结果也表明:不同类型的鼻咽癌细胞株之间c-Myc蛋白表达具有明显差异性，提示某些类型的鼻咽癌细胞株对外源性谷氨酰胺可能存在较强的依赖性。为验证这一假设，针对不同浓度梯度外源性谷氨酰胺处理的鼻咽癌细胞，采用台盼蓝染色计数法、CCK-8法、AnnexinⅤ和PI双染法、葡萄糖消耗检测试剂盒、放射细胞克隆形成实验、活性氧检测试剂盒、western blot等检测方法，发现外源性谷氢酰胺缺失可造成c-Myc高表达鼻咽癌细胞的生长增殖能力减弱、凋亡增加、细胞周期发生G1期停滞、葡萄糖代谢减慢、氧化还原失衡和放疗敏感性增强;而对于c-Myc低表达的鼻咽癌细胞，外源性谷氨酰胺缺失并未引起上述表象的出现，但伴随谷氨酰胺合成酶蛋白表达的上调。
　　既往研究提示，c-Myc高表达与鼻咽癌的局部控制不佳、易复发有关。我们同样观察到:c-Myc高表达的鼻咽癌细胞株具有生长增殖快、对放疗相对抵抗、对外源性谷氨酰胺有强烈的依赖性等特点。结合以上对鼻咽癌谷氨酰胺成瘾性的初步研究结果，我们推测靶向抑制谷氨酰胺代谢相关基因表达联合放疗，可能改善鼻咽癌的治疗效果。因此，我们以谷氨酰胺转运体溶质载体家族1第五成员(Solutecarrier family1，member5，SCL1A5)为研究靶点，构建shRNA-SLC1 A5慢病毒载体，观察SCL1A5沉默对谷氨酰胺成瘾的鼻咽癌细胞生长及放疗敏感性的影响。体外实验及在体动物研究结果均表明，SLC1A5蛋白水平下调对谷氨酰胺成瘾的鼻咽癌细胞的生长具有明显的抑制作用，并显著增加放疗的敏感性。
　　有研究表明，c-Myc可通过对谷氨酰胺转运体SLC1A5的直接调控，从而加速胶质瘤细胞的谷氨酰胺代谢。此外，作为鼻咽癌的主要致癌因素之一，EB病毒相关蛋白被认为参与了鼻咽癌细胞葡萄糖代谢的调控。为明确谷氨酰胺成瘾的鼻咽癌细胞是否同样存在c-Myc介导的谷氨酰胺代谢调控作用，以及EB病毒相关蛋白在谷氨酰胺代谢中的潜在调节作用，我们通过构建shRNA-c-Myc和EB病毒相关蛋白（EB病毒潜伏膜蛋白1、2A和EB病毒核抗原1）过表达慢病毒载体，发现c-Myc敲除可减少谷氨酰胺成瘾的鼻咽癌细胞CNE2的SLC1A5蛋白表达，并抑制外源性谷氨酰胺的摄取及细胞生长。尽管高表达外源性EB病毒相关蛋白对鼻咽癌细胞的生长具有促进作用，但并未引起谷氨酰胺代谢关键蛋白、谷氨酰胺摄取率和消耗量的明显改变。
　　综上所述，c-Myc/SLC1A5通路介导的谷氨酰胺代谢重编程可促进鼻咽癌的生长增殖以及放疗抵抗性;这一信号通路有望成为未来鼻咽癌治疗的潜在靶点。

目录

缩略语表

摘要

前言

第一部分 外源性谷氨酰胺对人鼻咽癌生物学特性及放疗敏感性的影响

一．实验材料和方法

二．实验结果

讨论

第二部分 靶向SLC1A5对鼻咽癌细胞株CNE2的生长及放疗抵抗性的影响

一．实验材料和方法

二．实验结果

讨论

第三部分 鼻咽癌细胞发生谷氨酰胺代谢重编程的潜在机制

二．实验材料和方法

二．实验结果

讨论

谷氨酰胺代谢在肿瘤发生及诊治中的研究进展

参考文献

致谢

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