表皮生长因子刺激对肺腺癌细胞系产生的外泌体的影响

摘要

肺癌是我国乃至全世界发病率和死亡率最高的肿瘤，其进展快、恶性程度高且极其容易转移。肿瘤产生的外泌体在肿瘤的发生、侵袭和转移方面都扮演者重要角色。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的过表达与EGFR信号通路的激活与肺腺癌的增殖、侵袭、转移、密切相关。但关于EGFR通路激活对肺腺癌产生的外泌体的影响，目前研究尚不够。
　　目的：
　　观察表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)刺激对肺腺癌细胞系产生的外泌体形态、粒径以及分泌量的影响，并探讨EGFR相关的促肿瘤增殖、转移作用能否能通过外泌体在肿瘤细胞间传递。
　　方法：
　　使用EGF刺激人肺腺癌H322细胞，梯度离心法分离其细胞上清中外泌体。采用透射电镜、纳米示踪分析、Western蛋白印记以及外泌体蛋白定量方法鉴定并比较EGF刺激组与对照组所得外泌体在形态、粒径以及分泌量方面的区别。
　　将上述两组外泌体与肺腺癌细胞共孵育后，检测肺腺癌细胞在增殖和转移方面的变化。
　　结果：
　　梯度离心所得到的颗粒具有外泌体典型杯状的结构，颗粒直径主要分布在40-150nm之间，表达外泌体标志性蛋白CD63和TSG101。EGF处理组与对照组相比，肺腺癌产生的外泌体在形态、粒径分布无明显影响，但分泌量明显增加。
　　两组外泌体都可促进肺腺癌细胞的增殖，但组间无统计学差异差异。而EGF处理组外泌体较对照组能提高肺腺癌的迁移能力，且具有统计学意义。
　　结论：
　　EGF刺激对肺腺癌细胞产生的外泌体的形态和粒径影响不明显，但可促进外泌体的分泌。EGFR相关促肿瘤转移作用可能通过外泌体在肿瘤细胞间传递。

目录

摘要

中英文缩略词表

引言

1 实验材料

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 实验溶剂

2 实验方法

2．1 细胞培养及表皮生长因子处理

2．1．1 细胞的复苏

2．1．2 细胞的培养和传代

2．1．3 细胞的冻存

2．1．4 表皮生长因子处理及细胞上清的收集

2．2 超高速离心法分离外泌体

2．3 外泌体的鉴定

2．3．1 透射电子显微镜观察外泌体的形态

2．3．2 纳米示踪分析观察外泌体浓度及粒径分布

2．3．3 Western印记检测外泌体内源性蛋白表达水平

2．4 荧光共聚焦显微镜观察肺腺癌细胞摄取外泌体

2．4．1 外泌体的染色

2．4．2 荧光共聚焦显微镜上样制片

2．5 细胞学实验

2．5．1 细胞增殖实验

2．5．2 细胞迁移实验

2．5．3 细胞侵袭实验

2．6 统计学分析方法

3 实验结果

3．1 EGF处理对外泌体的影响

3．1．1 EGF对肺腺癌H322细胞的影响

3．1．2 EGF刺激对外泌体形态和颗粒直径的影响

3．1．2 纳米颗粒云踪检测外泌体粒径分布与颗粒浓度

3．1．3 Western-blot蛋白印记检测外泌体特异性蛋白的表达

3．1．4 EGF处理对H322细胞外泌体分泌量的影响

3．2 EGF对外泌体生物学功能的影响

3．2．1 荧光共聚焦显微镜观察肺腺癌H322细胞摄取外泌体

3．2．2 EGF处理后H322细胞产生的外泌体对H322细胞增殖能力的影响

3．2．3 外泌体对细胞迁移能力的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

论文综述

致谢

声明